紫花苜蓿不同發(fā)育時(shí)期次生壁合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組分析

劉希強(qiáng)，張涵，龔攀，宮文龍，王贊

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是重要的多年生豆科牧草，具有生產(chǎn)潛力大，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)[1-2]，不論用來青飼、青貯、干草，還是放牧，都是最經(jīng)濟(jì)可靠的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料來源[3]，在畜牧業(yè)發(fā)展、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和生態(tài)文明建設(shè)中具有重要的地位與作用。次生壁（secondary cell wall，SCW）是植物細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)在初生壁內(nèi)側(cè)沉積形成有規(guī)則的疏水性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4]。LI[5]和 KOKUBO[6]等研究表明細(xì)胞壁會(huì)顯著影響水稻、大麥等作物的莖稈強(qiáng)度，與作物的產(chǎn)量，抗逆性和抗脅迫性直接相關(guān)。因此，探究紫花苜蓿次生壁的合成調(diào)控對(duì)提高其產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近十幾年來，關(guān)于次生壁合成調(diào)控的研究取得了顯著進(jìn)展，NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子和MYB（MYELOBLASTOSIS）結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控維管組織導(dǎo)管細(xì)胞和纖維細(xì)胞次生壁合成的轉(zhuǎn)錄開關(guān)因子[7-8]。NAC結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子有 VASCULARRELATED NAC DOMAIN1-7（VND1-7）[9]、NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING（NST1）、NST2和SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN 1（SND1）[10-12]。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子中有很多成員是次生壁合成網(wǎng)絡(luò)的次級(jí)調(diào)控因子，大部分處于NAC轉(zhuǎn)錄因子的下游，其中MYB46[13]和MYB83[14]被NAC轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控。NAC轉(zhuǎn)錄因子和 MYB轉(zhuǎn)錄因子形成分層級(jí)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素合成基因，調(diào)控細(xì)胞壁的次生加厚過程[15]。【本研究切入點(diǎn)】目前，次生壁合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在百日草（Zinnia elegans）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等模式植物中闡釋比較清晰[9,16]，但在非模式植物中研究很少。紫花苜蓿是一種高度雜合的同源四倍體植物，自交不親和，遺傳背景十分復(fù)雜，且全基因組測(cè)序尚未完成，通過傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法逐一地對(duì)次生壁合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中涉及的大量基因進(jìn)行研究，效率低，難度大。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）能夠全面快速地獲取紫花苜蓿莖在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息并且不需要其基因組信息[17]，可系統(tǒng)分析次生壁發(fā)育相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)紫花苜蓿不同發(fā)育時(shí)期的莖樣本進(jìn)行RNA-Seq，深入研究與次生壁加厚密切相關(guān)的纖維素、木質(zhì)素合成基因和轉(zhuǎn)錄因子在紫花苜蓿分枝期、現(xiàn)蕾期、初花期和盛花期的表達(dá)情況，以期比較全面地了解紫花苜蓿次生壁合成的基因網(wǎng)絡(luò)變化和表達(dá)模式，為紫花苜蓿次生壁合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為紫花苜蓿品質(zhì)和產(chǎn)量性狀的分子遺傳改良提供參考基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為‘中苜1號(hào)’紫花苜蓿（Medicago sativaL.cv. ‘Zhongmu No.1’），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。2015年7月于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平基地取單株‘中苜1號(hào)’莖枝若干，在人工氣候室扦插培養(yǎng)（光照強(qiáng)度＞450 μmol·m-2；溫度25℃；16 h光照/8 h黑暗；空氣濕度60%—80%），將扦插成活的植株移栽至昌平基地。2016年4月開始觀測(cè)記錄‘中苜1號(hào)’扦插材料的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，在中國(guó)苜蓿生育期劃分的基礎(chǔ)上結(jié)合美國(guó)單株苜蓿生育階段劃分標(biāo)準(zhǔn)[18]確認(rèn)試驗(yàn)材料的生長(zhǎng)時(shí)期。分別采集紫花苜蓿分枝期（S1，株高 16—25 cm，無花蕾）、現(xiàn)蕾期（S2，1個(gè)或2個(gè)花芽有花蕾，無花和莢果）、初花期（S3，僅有一個(gè)花芽開花，無莢果）和盛花期（S4，不少于 2個(gè)花芽完全開花）的主莖，頂部和基部各去除3節(jié)，保留莖中部。每個(gè)時(shí)期的莖樣設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，取樣后立即置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱。用于物質(zhì)含量測(cè)定的莖樣65℃烘箱烘干，粉碎，過70目篩，收集待用。

1.2 近紅外光譜法測(cè)定

采用FOSS5000近紅外光譜快速品質(zhì)分析儀（丹麥FOSS公司），儀器光源為鹵鎢燈，硫化鉛探測(cè)器，譜區(qū)范圍：1 100—2 500 nm。光譜間隔2 nm，掃描次數(shù)32次。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，放入分析儀檢測(cè)盒中進(jìn)行光譜掃描，利用建立的紫花苜蓿近紅外檢測(cè)模型，獲取樣品NDF（中性洗滌纖維）、ADF（酸性洗滌纖維）、Lignin（木質(zhì)素）、ASH（灰分、無機(jī)物）和DM（干物質(zhì)）成分含量。纖維素含量=ADF-ASHLignin[19]。

1.3 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用Trizol試劑（購于Invitrogen公司）提取‘中苜1號(hào)’莖的總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，使用Agilent Bioanalyzer 2100 system對(duì)RNA精確質(zhì)檢。將檢測(cè)合格的總RNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)序，構(gòu)建cDNA文庫，在Illumina HiSeqTM2500測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，輸出數(shù)據(jù)為pair-end序列（2×150 bp）。

1.4 基因功能注釋

測(cè)序輸出數(shù)據(jù)為原始序列（raw reads），對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控（QC），經(jīng)過濾去除接頭序列和低質(zhì)量序列得到干凈序列（clean reads），以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。以紫花苜蓿的近緣物種蒺藜苜?；蚪M（http://www.medicagogenome.org/ downloads）作為參考基因組，利用軟件HISAT2（v2.2.0.4）將clean reads比對(duì)到參考基因組序列，使用 Cufflinks[20]（v2.1.1）軟件將比對(duì)結(jié)果組裝構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本，選擇最完整的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene。使用Blast（v2.2.28）將Unigene序列與Nr（NCBI non-redundant protein sequences）、Nt（NCBI nucleotide sequences）、MTGD（Medicago truncatulaGenome Database）、KOG（euKaryotic Ortholog Groups）等公共數(shù)據(jù)庫比對(duì)，匹配率≥80%且E-value≤1E-5，獲取Unigene注釋信息。本研究所有基因注釋ID都以蒺藜苜?；蚪M基因ID表示。

1.5 基因表達(dá)量計(jì)算和差異基因篩選

通過FPKM法計(jì)算基因表達(dá)量，得到的FPKM值可直接用來表示基因的表達(dá)水平[21]。參照 AUDIC等[22]方法，以Fold change（差異表達(dá)倍數(shù)）≥2或≤0.5（表達(dá)上調(diào)或下調(diào)），F(xiàn)DR（False discover rate）≤0.05為篩選條件，在3個(gè)相鄰時(shí)期轉(zhuǎn)錄組比較組合中（S2 VS S1，S3 VS S2，S4 VS S3）選取差異表達(dá)基因。FDR值越小，表達(dá)差異越顯著。利用 TopGO（v2.10.0）軟件在GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫中對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集和功能注釋；同時(shí)利用KOBAS（v2.0.12）軟件在 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫中搜索差異表達(dá)基因的 KEGG注釋信息[23]，確定差異表達(dá)基因參與的代謝途徑。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇 8個(gè)與次生壁加厚相關(guān)的差異表達(dá)基因，利用 Primer-NCBI在線設(shè)計(jì)引物（表1），進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR驗(yàn)證分析。將 RNA采用第 1鏈cDNA合成試劑盒（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，MsActin為內(nèi)參，采用TaKaRa（日本）公司的 SYBR?Premix Ex Taq?II（Tli RNaseH Plus）試劑盒，在ABI 7500FAST熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)）進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，依照2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[24]。

2 結(jié)果

2.1 次生壁主要物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

近紅外光譜法測(cè)定結(jié)果顯示（圖1），紫花苜蓿莖的纖維素和木質(zhì)素含量在不同發(fā)育時(shí)期變化較大，特別是纖維素含量在初花期和盛花期顯著提高，初花期含量相較于分枝期提高2.7倍?？傮w上隨著紫花苜蓿莖的成熟，次生壁中纖維素和木質(zhì)素含量逐漸升高。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR

圖1 不同發(fā)育時(shí)期次生壁主要物質(zhì)含量Fig. 1 The main substance contents of secondary cell wall at different developmental stages

2.2 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及差異基因篩選結(jié)果

4個(gè)發(fā)育時(shí)期的12個(gè)樣本測(cè)序共得到5 872.8萬—7 037.2萬條原始序列，質(zhì)控得到5 446.4萬—6 726.9萬條有效序列，占原始序列94.8%—96.9%。與蒺藜苜?；蚪M進(jìn)行基因序列比對(duì)，成功比對(duì)4 071.2萬—4 979.9萬條序列，比對(duì)率為70.3%—74.5%（表2）。對(duì) 12個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行比對(duì)和重新組裝，共獲得69 059個(gè)轉(zhuǎn)錄本，選擇41 734（60%）個(gè)轉(zhuǎn)錄本作為Unigene。

經(jīng)篩選得到相鄰時(shí)期間（S2 VS S1，S3 VS S2，S4 VS S3）的差異表達(dá)基因（圖2），其中97.87%的基因在4個(gè)時(shí)期均有表達(dá)。現(xiàn)蕾期與分枝期的差異表達(dá)基因?yàn)? 648個(gè)，上、下調(diào)基因分別為2 111個(gè)和 537個(gè)；初花期與現(xiàn)蕾期的差異表達(dá)基因?yàn)? 283個(gè)，上、下調(diào)基因分別為1 521個(gè)和762個(gè)；盛花期與初花期的差異表達(dá)基因?yàn)? 354個(gè)，上、下調(diào)基因分別為875個(gè)和479個(gè)。

圖2 相鄰發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)基因Fig. 2 Differentially expressed genes at adjacent developmental stages

2.3 纖維素合成酶基因的差異表達(dá)分析

根據(jù)基因功能注釋，在相鄰時(shí)期間的差異表達(dá)基因中篩選獲得 10個(gè)纖維素合成酶基因（cellulose synthase gene）。結(jié)果顯示（圖3），紫花苜蓿莖細(xì)胞壁次生加厚過程中，多個(gè)纖維素合成酶基因表達(dá)水平上調(diào)，特別是在初花期和盛花期，基因表達(dá)量較分枝期發(fā)生顯著增加，而現(xiàn)蕾期與分枝期相比，表達(dá)量顯著上調(diào)或下調(diào)的差異基因較少。基因MTR_2g087960、MTR_3g005560和MTR_4g055520的表達(dá)水平在初花期顯著下調(diào)。

2.4 木質(zhì)素合成途徑中的基因差異表達(dá)分析

將差異表達(dá)基因在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中注釋分析，獲得苯丙氨酸次生代謝中木質(zhì)素單體合成途徑中的差異表達(dá)基因[25]，KEGG Pathway map ID：mtr00940（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway/mtr00940）。17個(gè)差異表達(dá)基因分別注釋為苯丙氨酸氨基裂解酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）、4-羥基肉桂酰輔酶 A 連接酶（4-（hydroxy）cinnamoyl-CoA ligase，4CL）、肉桂酰輔酶 A還原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）、肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD）、咖啡酸/5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Caffeic acid/5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase，COMT）、阿魏酸-5-羥化酶（Ferulate 5-hydroxylase，F(xiàn)5H）等木質(zhì)素單體合成途徑中的關(guān)鍵合成酶基因（圖4）。

表2 紫花苜蓿不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of transcriptome data of alfalfa at different developmental stages

圖3 紫花苜蓿纖維素合成酶差異表達(dá)基因變化趨勢(shì)Fig. 3 Tendency of differentially expressed genes of cellulose synthase in alfalfa

利用GraphPad Prism 7（v7.03）軟件對(duì)差異表達(dá)基因在4個(gè)時(shí)期的表達(dá)水平做進(jìn)一步分析（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素單體合成途徑中上游基因PAL、C4H、4CL和CCR的表達(dá)水平變化趨勢(shì)與多數(shù)纖維素合成酶基因一致，在初花期和盛花期表達(dá)量顯著上調(diào)，其中 MTR_1g064090（PAL1）、MTR_1g111240（C4H）和 MTR_2g104960（CCR）的基因表達(dá)量相比分枝期上調(diào) 10倍以上。而下游調(diào)控基因CAD和COMT的表達(dá)變化趨勢(shì)與上游調(diào)控基因相反，在分枝期和現(xiàn)蕾期表達(dá)水平較高，在初花期和盛花期表達(dá)水平顯著下調(diào)。

圖4 苯丙氨酸生物合成途徑（KEGG Pathway map ID：mtr00940）Fig. 4 Phenylpropanoid biosynthetic pathways in KEGG

2.5 次生壁發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，參考北京大學(xué)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB（http//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）公布的蒺藜苜蓿轉(zhuǎn)錄因子家族序列信息，共獲得27個(gè)可能與次生壁合成調(diào)控相關(guān)的差異轉(zhuǎn)錄因子（表3）。

差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子主要有NAC家族和MYB家族轉(zhuǎn)錄因子共18個(gè)，也有少量WRKY、BHLH、ERF、C3H等轉(zhuǎn)錄因子。8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在現(xiàn)蕾期到初花期上調(diào)表達(dá)，初花期到盛花期表達(dá)水平變化差異較小，19個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在現(xiàn)蕾期到初花期或初花期到盛花期顯著下調(diào)。這些轉(zhuǎn)錄因子涉及植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、形態(tài)建成、抗逆脅迫等各種生物代謝途徑。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

通過對(duì)qRT-PCR和RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析（圖6），結(jié)果較為一致，相關(guān)系數(shù)在0.571—0.994，證明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)具有較高的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

3 討論

在紫花苜蓿莖生長(zhǎng)發(fā)育過程中，3個(gè)相鄰時(shí)期比較組合中（S2 VS S1，S3 VS S2，S4 VS S3）表達(dá)上調(diào)基因的數(shù)量皆大于表達(dá)下調(diào)基因的數(shù)量，但差異表達(dá)基因的數(shù)量在不斷減少，其中上調(diào)表達(dá)基因顯著減少，在盛花期，上調(diào)表達(dá)基因和下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量接近，總體上反應(yīng)了紫花苜蓿莖從分枝期到盛花期在生物過程、細(xì)胞代謝、分子功能等方面增強(qiáng)趨勢(shì)較為明顯，但在生長(zhǎng)后期趨勢(shì)變緩。

圖5 紫花苜蓿木質(zhì)素單體合成途徑中的差異表達(dá)基因在不同時(shí)期的表達(dá)模式Fig. 5 The expression pattern of differentially expressed genes in the biosynthesis pathway of monolignol at four developmental stages in alfalfa

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與RNA-seq相關(guān)性分析Fig. 6 Correlation between qRT-PCR and RNA-seq

JUNG等[26]研究表明紫花苜蓿莖的細(xì)胞壁物質(zhì)組分與生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期密切相關(guān)。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期僅初生木質(zhì)部維管組織細(xì)胞壁有少量木質(zhì)素沉積，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)期，節(jié)間伸長(zhǎng)逐漸停止，次生木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞大量生成且迅速沉積木質(zhì)素，髓薄壁細(xì)胞也開始木質(zhì)化。隨著苜蓿莖的成熟，果膠質(zhì)含量逐漸降低，纖維素含量逐漸升高。纖維素是植物細(xì)胞壁組分中含量最多的化合物，它的排列模式?jīng)Q定了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)[27]。ZHANG 等[28]發(fā)現(xiàn)OsCESA4、OsCESA7和OsCESA93個(gè)基因發(fā)生突變后，水稻植株均出現(xiàn)明顯的脆性，同時(shí)纖維素含量降低，次生壁變薄，植株表型異常。本研究中27個(gè)功能注釋與紫花苜蓿纖維素、木質(zhì)素合成密切相關(guān)的基因差異表達(dá)，其變化趨勢(shì)與次生壁中纖維素和木質(zhì)素含量測(cè)定結(jié)果基本一致，即隨著生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的變化，表達(dá)水平逐漸提高。研究表明，初花期是紫花苜蓿次生壁合成調(diào)控的轉(zhuǎn)折期，纖維素和木質(zhì)素含量與其合成基因表達(dá)量在初花期均顯著增加。MTR_2g016630（Ces）和MTR_7g103590（Ces A1）等纖維素合成酶基因表達(dá)水平在初花期顯著上升，木質(zhì)素合成途徑中，MTR_1g064090（PAL1）、MTR_1g111240（C4H）和MTR_2g104960（CCR）基因表達(dá)量在初花期或盛花期相比分枝期增加10倍以上。上述差異表達(dá)基因很可能參與調(diào)控紫花苜蓿纖維素和木質(zhì)素的含量/組分變化，為篩選影響次生壁加厚進(jìn)程的主效基因提供了理論依據(jù)。

表3 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平Table 3 Expression level of differentially expressed transcription factors

次生壁的合成加厚過程涉及大量轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的調(diào)控，對(duì)差異表達(dá)的MYB和NAC轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥中參與次生壁合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行同源進(jìn)化分析。圖7-A中MTR_8g102240與AtSND2、AtSND3組成一類，相似性為 90%。ZHONG等[29]研究表明AtSND2和AtSND3是由AtSND1直接調(diào)控的次級(jí)轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控次生壁的加厚。MTR_8g102240可能具有AtSND2和AtSND3類似的功能。圖7-B中MTR_2g067420與AtMYB58和AtMYB63有94%的相似性。AtMYB58和AtMYB63在次生壁物質(zhì)沉積加厚的細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)，受轉(zhuǎn)錄開關(guān)因子AtSND1及其下游轉(zhuǎn)錄因子AtMYB46調(diào)控，通過結(jié)合木質(zhì)素單體合成途徑中的關(guān)鍵酶如4CL、F5H等啟動(dòng)子上的 AC元件激活基因表達(dá)，是木質(zhì)素生物合成中重要的調(diào)控因子[30-31]，MTR_2g067420也可能具有類似功能。MTR_8g102240和MTR_2g067420可作為候選基因，利用突變體確定其表型，通過過表達(dá)或抑制該基因表達(dá)進(jìn)行后續(xù)功能驗(yàn)證分析。近期研究結(jié)果表明WRKY[32]、BHLH[33]、KNAT7[34]、C3H[35]等轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、苜蓿、楊樹中參與次生壁的合成調(diào)控，WANG等[32]在苜蓿和擬南芥中發(fā)現(xiàn)WRKY12可與NST2的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合抑制髓細(xì)胞中木質(zhì)素、木聚糖和纖維素的沉積；AtC3H14是MYB46的靶蛋白，能激活大多數(shù)次生壁生物合成基因的表達(dá)[36]。

圖7 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 7 Phylogenetic analysis of differentially expressed transcription factors

4 結(jié)論

獲得紫花苜?！熊?號(hào)’在4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期莖的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，共獲得 54個(gè)差異表達(dá)基因，其中穩(wěn)定上調(diào)基因24個(gè)，穩(wěn)定下調(diào)基因30個(gè)。這些基因可能參與紫花苜蓿次生壁的合成調(diào)控。

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