厚唇魚CO1基因與CYTB基因克隆與結(jié)構(gòu)特征分析

廖莉莉 謝永廣 陳敦學(xué)

線粒體作為一種磷脂雙分子層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，存在于幾乎所有的真核生物中。同時(shí)線粒體作為真核生物主要的供能器官，不僅可以通過氧化磷酸化作用為真核生物提供超過95%的能量[1]，同時(shí)由于線粒體DNA的高進(jìn)化速率和特殊的結(jié)構(gòu)特征，線粒體DNA也被作為一種分析物種進(jìn)化的有效工具[2]。

線粒體DNA在脊椎動物中，具有較為保守的結(jié)構(gòu)，其基因組共包含13個(gè)編碼蛋白基因，2個(gè)rRNA基因，一個(gè)非編碼的控制區(qū)，此外還包含22個(gè)tRNA間隔分布在13個(gè)編碼蛋白基因之間。其分子量大約在16kb左右，由于缺乏自我修復(fù)系統(tǒng)以及母系遺傳特征，線粒體DNA被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化分析及物種鑒定。CO1和CYTB基因往往被作為分析物種進(jìn)化的有效工具而被廣泛使用。Chen（2010）利用線粒體16S rRNA基因，CO1基因，以及CYTB基因分析了鱖類遺傳分析[3]；柳淑芳（2010）利用CO1基因構(gòu)建了石首魚科的條形碼，并進(jìn)行了其系統(tǒng)分類研究[4]；彭居俐（2009）利用CO1基因進(jìn)行了鯉科鲌屬魚類物種鑒定[5]；胡靜（2014）利用CO1和CYTB基因分析了南中國海不同海域波紋唇魚群體遺傳多樣性[6]；陳抒云（2015）利用CO1和CYTB基因進(jìn)行了蟲草屬物種的寄主鑒定[7]。

自然狀態(tài)下，光唇魚廣泛分布在河流和小溪的礫石沉積物中。由于厚唇魚必須生長在優(yōu)良水質(zhì)中，因此厚唇魚又被認(rèn)為是水環(huán)境的檢測者[8，9]。同時(shí)由于厚唇魚具有漂亮的體色，又被作為觀賞魚養(yǎng)殖，深受廣大消費(fèi)者喜愛。目前有超過10種厚唇魚屬被鑒定與報(bào)道過[10]，厚唇魚（A. labiatus）作為厚唇魚屬的重要物種，卻很少被注意與研究，因此本研究擬以厚唇魚CO1和CYTB基因?yàn)橐劳?，分析厚唇魚的進(jìn)化特征。

1、材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)所需厚唇魚來至貴州省凱里市，用無水乙醇浸泡保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)所用生物試劑均為國產(chǎn)或者進(jìn)口儀器，測序委托上海博尚生物有限公司完成。

1.2 基因組DNA的提取與鑒定

厚唇魚基因組的提取采用天根生物公司的基因組組提取試劑盒進(jìn)行提取，同時(shí)采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測定吸光度確定濃度。

1.3 引物設(shè)計(jì)，PCR與數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)采用同源克隆技術(shù)進(jìn)行克隆，以厚唇魚屬的A. fasciatus和A. Parallens序列為參考，設(shè)計(jì)CO1與CYTB基因克隆引物，構(gòu)建克隆載體并進(jìn)行雙向測序分析，并對測序結(jié)果進(jìn)行拼接與評價(jià)。

2、結(jié)果與分析

2.1 CO1與CYTB基因結(jié)構(gòu)特征分析

將測序得到的序列進(jìn)行拼接，去除重復(fù)序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)厚唇魚CO1與CYTB基因分別長度為1551bp與1141bp，分別編碼516與380個(gè)氨基酸。其起始密碼子分別為GTG與ATG，終止密碼子分別為GAA和T--，其中CYTB出現(xiàn)了不完全終止密碼子。分析發(fā)現(xiàn)CO1與CYTB基因本身沒有特殊的A+T偏好性，然而，在第三位堿基上，其G堿基含量卻明顯偏低，分別為7.0和5.8，遠(yuǎn)低于一般情況，此外，整個(gè)CO1基因與CYTB基因的G堿基含量都偏低（17.3和14.6）。這種情況在脊椎動物線粒體中是比較常見的現(xiàn)象。

在分析相近物種進(jìn)化過程中，由于GC-skew在屬內(nèi)或者相近物種中，具有較大變化，因此分析物種的GC-skew對分析物種的進(jìn)化也具有重要作用[11]，因此本文分析了11種厚唇魚屬CO1和CYTB的GC-skew，結(jié)果顯示厚唇魚屬的GC-skew均呈現(xiàn)負(fù)值，且CYTB的GC-skew值明顯小于CO1，而分析其AT-skew時(shí)卻出現(xiàn)CO1為負(fù)值，CYTB為正值的情況，這與在全基因組上的結(jié)果不完全一致，脊椎動物全基因組一般都是CC-skew屬于負(fù)值，而AT-skew主要偏向正值，具體原因可能是由于線粒體各個(gè)編碼蛋白基因的進(jìn)化速率不一樣造成的。

2.2基因CO1與CYTB的進(jìn)化分析

為了研究厚唇魚屬的物種進(jìn)化關(guān)系，我們利用MEGA4.0軟件，采用N-J分別構(gòu)建的基因CO1和CYTB的進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系，其中Spinibarbus sinensis和Onychostoma rara作為外群，結(jié)果顯示厚唇魚屬并沒有完全聚成一簇，其中CO1中，選用的外群全部并入了厚唇魚屬，而在CYTB中，外群Spinibarbus sinensis作為獨(dú)立的一支分化出來，而Onychostoma rara卻依舊和厚唇魚屬并在一起，以上結(jié)果顯示厚唇魚屬可能非單系起源。我們研究的厚唇魚的親緣關(guān)系確是確定的，首先是A. parallens 和A. Hemispinus聚成一支，然后在和我們的A.labiatus 進(jìn)行聚合，這說明我們研究的厚唇魚為一個(gè)獨(dú)立的物種。

進(jìn)化關(guān)系的準(zhǔn)確性，與序列長短正相關(guān)，為了進(jìn)一步闡明厚唇魚屬的物種進(jìn)化關(guān)系，我們將所克隆得到的CO1基因與CYTB基因進(jìn)行拼接后利用MEGA4.0軟件構(gòu)建NJ進(jìn)化樹分析，結(jié)果見圖三，結(jié)果與CYTB構(gòu)建進(jìn)化樹基本一樣，然而，對研究中的厚唇魚還是有少量差別，主要體現(xiàn)在小分支之間的差別。

3、討論

3.1線粒體基因進(jìn)化的適用性分析

在系統(tǒng)進(jìn)化分析中，由于不同的基因片段進(jìn)化速率不一樣，選擇合適的區(qū)段進(jìn)行分析一直是研究進(jìn)化分析的難點(diǎn)，早期的研究中，受限于數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)量的限制，只能進(jìn)行利用長片段進(jìn)行高級階元的分析，例如Zardoya就選用了8種脊椎動物的線粒體基因組的高級階元的分析[12]。隨著數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量的增大，選擇一個(gè)或者幾個(gè)具有代表性的片段簡單快捷的分析物種的進(jìn)化關(guān)系就顯得尤為重要了。早期研究中Zardoya認(rèn)為CO1和CYTB具有很好的適用性，然而Miya卻認(rèn)為CO1與CYTB不具有最好的適用性[13]。在本研究中，我們采用目前通用的CO1和CYTB進(jìn)行進(jìn)化分析。

3.2線粒體堿基組成與使用規(guī)則分析

線粒體基因具有較好的保守性，比較分析其堿基組成發(fā)現(xiàn)CO1基因與CYTB基因中，其G堿基含量都非常低，這與所報(bào)道的硬骨魚類線粒體基因組G堿基含量低是一致的。同時(shí)分析整個(gè)厚唇魚屬的AT-skew和GC-skew，發(fā)現(xiàn)其數(shù)值變化趨勢也基本一樣，且數(shù)值差別不大，這似乎可以證明厚唇魚屬分化時(shí)間還不長，彼此之前差別也不大，與進(jìn)化分析結(jié)果一致的。

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