凍干蟾皮凝膠劑質(zhì)量標準及初步藥效學研究

閭紅燕 黃繩武

[摘要] 目的 建立凍干蟾皮凝膠劑質(zhì)量標準和初步藥效學研究。方法 采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的華蟾酥毒基和酯蟾毒配基進行定性鑒別，高效液相色譜（HPLC）法測定華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量，色譜柱kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）（48︰52）；流速：1 mL/min；檢測波長：296 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。采用S180腹水型實體瘤小鼠進行初步抑瘤藥效學研究。結(jié)果 硅膠G薄層板上，在與對照品色譜對應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點，且斑點大小適中，分離度良好。華蟾酥毒基和酯蟾毒配基分別在0.056～4.48 μg/mL，0.256～10.24 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度存在良好的線性關(guān)系（r=0.9987、0.9996）。加樣回收率（n=6）為100.27%、101.68%，相對標準偏差為1.56%、1.67%。初步藥效學結(jié)果顯示凍干蟾皮凝膠劑不同劑量組均有顯著抗腫瘤作用，且高劑量組效果最佳，抑瘤率為48.03%。結(jié)論 建立了凍干蟾皮凝膠劑質(zhì)量標準，初步藥效學表明凍干蟾皮凝膠劑具有顯著抗腫瘤作用。

[關(guān)鍵詞] 凍干蟾皮凝膠劑；質(zhì)量標準；抗腫瘤；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（a）-0029-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard and preliminary pharmacodynamic study of Freeze-dried Toad Skin Gel. Methods TLC was used for the qualitative identification of Cinobufagin and Resibufogenin， HPLC was adopted to determine content of Cinobufagin and Resibufogenin. Chromatographic column： kromasil C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； flowing phase： acetonitrile （A）- water （B） （48∶52）； flow rate： 1 mL/min； UV detection wavelength： 296 nm； column temperature： 30℃； the volume： 10 μL. S180 ascites solid tumor mice were used to study the pharmacodynamics of inhibition of tumor growth. Results The fluorescence spots of the same color were shown in the corresponding position of the Silica gel G thin layer， and the spot size was moderate and the separation degree was good. Cinobufagin and Resibufogenin showed good linearity between the peak area and the concentration in the range of 0.056-4.48 μg/mL （r=0.9987） and 0.256-10.24 μg/mL （0.9996）， respectively. The sample recovery rate（n=6） was 100.27%， 101.68%， RSD was 1.56% and 1.67%. The Preliminary pharmacodynamics study showed that all groups of Freeze-dried Toad Skin Gel had significant anti-tumor effect， and the high-dose group had the best effect， with the inhibitory rate of 48.03%. Conclusion The quality standard of Freeze-dried Toad Skin Gel is established， and the preliminary pharmacodynamics shows that it has a significant anti-tumor effect.

[Key words] Freeze-dried Toad Skin Gel； Quality standard； Anti-tumor； Cinobufagin； Resibufogenin

蟾皮（Corium bofonis），又稱蛤蚆皮（《醫(yī)方約說》），癩蟆皮（《中藥材手冊》），蟾蜍皮、蛤蟆皮（《中草藥學》），為蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufo bufogargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的干燥皮，自古至今沿用，其性味辛、涼、微毒，主入胃經(jīng)，具有清熱解毒，利水消脹的功效，近年來，用于多種癌癥的治療和配合放、化療，不僅能夠有效抑制癌細胞的過度增殖，還具有改善血象，減輕放、化療毒副作用的功效[1-3]。凍干蟾皮凝膠劑為鮮蟾皮低溫冷凍干燥后采用超微粉碎技術(shù)[4]，并輔以高分子材料為基質(zhì)制成的外用凝膠劑[5-7]，該劑型劑量可控，透皮吸收迅速[8-9]，藥物吸收干擾因素小，避免藥物的肝臟首過作用[10-11]，血藥濃度穩(wěn)定，能夠有效提高藥物生物利用度，并可反復敷貼，隨時停藥，使用方便，對皮膚無刺激性和致敏性[12-14]。

制訂中藥制劑的質(zhì)量標準是制劑制備的最終目標，控制制劑的質(zhì)量，以保證臨床試驗藥品和上市藥品的質(zhì)量有效和安全。本文參照《中國藥典》2015年版（四部）附錄通則0114凝膠劑相關(guān)檢查項，包括外觀性狀、pH值檢查、薄層鑒別、含量測定等，以確保藥品安全、有效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

天美公司LC2000梯度系統(tǒng)；LC2130輸液泵（日本原裝進口），配梯度洗脫和在線脫氣裝置；LC2030紫外檢測器；手動進樣器7725i；色譜工作站T2000P；AB104-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（FA2004，常州市幸運電子設(shè)備有限公司）；智能透皮試驗儀（YB-P6，天津藥典標準儀器廠制造）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，常州澳華儀器有限公司）。

1.2 藥品和試劑

凍干蟾皮凝膠劑（實驗室自制）；對照品酯蟾毒配基（中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110718-200507），對照品華蟾酥毒基（中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110803-200605）；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：11072821）；環(huán)己烷（上海強順化學試劑有限公司，批號：20151101）；三氯甲烷（衢州巨化試劑有限公司，批號：20150501）；丙酮（浙江杭州大方化學試劑廠，批號：20140926）；生理鹽水（中國廣州百特醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)，批號：GS1105064）；甲醇、乙醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

小鼠S180腹水型腫瘤細胞和細胞株（由浙江省醫(yī)科院提供）；健康美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠，雌雄各半，SPF級，年齡4～6周，體重18～22 g。購于上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學中藥資源與鑒定教研室實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫為（22 ± 2）℃，濕度為（50 ± 10）%。

2 方法與結(jié)果

2.1 理化性質(zhì)考察

2.1.1 性狀 本品為深灰色半固體，質(zhì)地均勻，細膩，黏度適宜，涂展性好，氣微腥。

2.1.2 酸堿度 人體皮膚表面呈偏酸性，其pH值介于5.5～7.0之間，皮脂具有中和酸堿的能力，對酸性和堿性物質(zhì)有緩沖作用[6]，取凍干蟾皮凝膠劑1 g，加入20 mL蒸餾水，超聲30 min，使其完全分散，室溫下放置30 min，取上清液測pH，測得其平均pH值為6.7。

2.1.3 鑒別 精密稱取華蟾酥毒基1.4 mg和酯蟾毒配基1.1 mg，甲醇定容至10 mL，配制成混合對照品。精密取3批凍干蟾皮凝膠劑和空白凝膠劑各1 g，加甲醇10 mL，稱重，分散，回流1 h，放冷，補足失重，過濾，取濾液。參照《中國藥典》2015年版（四部）通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（4∶3∶3）為展開劑展開，取出，晾干后噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，待溶液揮干后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜對應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點，且斑點大小適中，分離度良好（圖1）。外用制劑對黏度有一定的要求，應用黏度計測定凍干蟾皮凝膠劑的黏度。按《中國藥典》2015年版（四部）通則0633黏度測定法第三法，室溫下用旋轉(zhuǎn)黏度計測定3批凝膠劑平均黏度為29.03 Pa·s。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）色譜柱：kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（瑞典）；流動相：乙腈（A）-水（B）（48∶52）；流速：1 mL/min；檢測波長：296 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL[15-17]。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取華蟾素毒基1.4 mg，酯蟾毒配基3.2 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，作為對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取3批凍干蟾皮凝膠劑0.4 g，加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流提取60 min，室溫冷卻，甲醇補足失重，過濾，取濾液，過膜，作為供試品儲備液。

2.2.4 最大波長的選擇 精密稱取華蟾酥毒基和酯蟾毒配基對照品適量，用甲醇配制成對照品溶液，以甲醇為空白，分別在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果對照品溶液在296 nm波長附近有最大吸收，故選擇測定波長為296 nm。

2.2.5 專屬性考察 精密移取對照品儲備液1 mL置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，精密移取3.5 mL置于10 mL容量瓶中，作為稀釋后對照品溶液；取“2.2.3”項下供試品溶液；取溶劑甲醇進樣，每次進樣10 μL，按上述色譜條件測定。結(jié)果顯示，在此色譜條件下，溶劑不干擾主藥的測定（圖2）。

2.2.6 標準曲線的繪制 取上述對照品儲備液1.0 mL置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，精密移取0.1、0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0 mL置于10 mL容量瓶中，過膜，進樣10 μL。以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，華蟾酥毒基線性回歸方程Y=4714.3964X-253.3696，r=0.9987，酯蟾毒配基線性回歸方程Y=33 255.0527X-28.2238，r=0.9996，可見華蟾酥毒基和酯蟾毒配基分別在0.056～4.48、0.256～10.24 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度存在良好的線性關(guān)系。

2.2.7精密度試驗 精密移取上述對照品儲備液1 mL置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，精密移取3.5 mL置于10 mL容量瓶中，過膜，進樣10 μL。結(jié)果顯示，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基相對峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于2%（表1），表明儀器的精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 精密平行稱取同一批凍干蟾皮凝膠劑6份，按照“2.2.3”項下供試品制備方法制備，所得樣品按以上色譜條件連續(xù)平行進樣6次，分別測定華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量。結(jié)果顯示，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基濃度RSD均小于3%（表2），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 精密稱取凍干產(chǎn)品凝膠劑0.4 g，按照“2.2.3”供試品處理方法制備供試品溶液。分別于0、2、4、8、16、24 h時注入液相色譜儀，測定供試品溶液中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：華蟾酥毒基和酯蟾毒配基濃度RSD均小于2%（表3），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 回收率試驗 精密稱取對照品華蟾酥毒基和酯蟾毒配基適量，加入到已知濃度兩者含量的供試品中，在以上色譜條件下，測定兩者含量，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基平均回收率分別為100.27%、101.68%，RSD均小于2%（表4、5），表明該方法準確性良好。

2.2.11 含量測定方法 分別取批號20170322、20170327和20170411共3批凍干蟾皮凝膠劑，按照“2.2.3”項下的供試品制備方法處理，平行制備6份供試品溶液。按照“2.2.1”項下的色譜條件進樣10 μL，測定峰面積。測得樣品中華蟾酥毒基分別為208.77、199.74、207.32 μg/g；酯蟾毒配基分別為192.22、181.87、186.63 μg/g。結(jié)果表明，即每l克凝膠所含華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量分別不得低于190 μg和180 μg，兩者總量不低于370 μg。

2.3 初步藥效學研究

2.3.1 S180荷瘤小鼠模型建立 自液氮罐中取出S180腹水型腫瘤細胞株1支，置于37℃電熱恒溫水浴鍋內(nèi)，輕輕搖動使其緩慢融化，取出凍存管，用酒精消毒后備用，吸出細胞懸液，注入離心管并滴加15%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，制成腫瘤細胞混懸液，臺盼藍計數(shù)約為1×107/mL瘤細胞。消毒小鼠背臀部，取0.2 mL（1×106～2×106個瘤細胞）接種于皮下，傳代3次[11-12]。選擇接種8 d的S180荷瘤小鼠，脫頸處死，抽取小鼠腹腔內(nèi)腹水，用生理鹽水適當稀釋后，計數(shù)，調(diào)整濃度至2×107，用無菌注射器吸取瘤細胞混懸液注射在小鼠背臀部，每只0.2 mL，4～6 d后背臀部測量腫瘤體積均達50～80 mm3。

2.3.2 實驗分組和給藥 接種瘤細胞后的ICR小鼠60只，稱重記錄體重，按體重和性別隨機分為6組，分別為凍干蟾皮凝膠劑高劑量組4 g/kg（蟾皮高劑量組）、凍干蟾皮凝膠劑中劑量組2 g/kg（蟾皮中劑量組）、凍干蟾皮凝膠劑低劑量組1 g/kg（蟾皮低劑量組）、蟾酥凝膠劑中劑量組0.054 g/kg（蟾酥中劑量組）、空白凝膠劑組（陰性組）、環(huán)磷酰胺組0.5 mg/20 g（陽性組），每組10只，每只均單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫為（22 ± 2）℃，濕度為（50 ± 10）%。所有小鼠均于12 h光照和12 h黑暗環(huán)境下適應性飼養(yǎng)數(shù)天，自由飲食飲水。給藥之前禁食12 h，全程不禁水。

2.3.3 數(shù)據(jù)收集 除陽性組腹腔注射外，其余組別均采用背臀部涂抹給藥連續(xù)20 d，觀察記錄小鼠的一般情況（外觀、毛色、飲食、行為、分泌物、排泄物、中毒表現(xiàn)和死亡情況等），每日稱荷瘤小鼠重量，停藥后第2天記錄體重，處死后解剖，剝?nèi)∧[瘤組織、脾臟、胸腺，電子天平精密稱重。

2.3.4 檢測指標 抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重）×100%；脾指數(shù)=脾重量（mg）/體重（g）；胸腺指數(shù)=胸腺重量（mg）/體重（g）。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0版統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2.5 實驗結(jié)果

在觀察期間小鼠的一般情況總體良好，由于腫瘤接種于小鼠背臀部，該部位血管分布較少，導致腫瘤生長相對緩慢，對小鼠活動能力無顯著影響，實驗過程中無小鼠死亡。在接種后5～7 d，肉眼可見實體瘤生成，各組小鼠給藥后的抑瘤率情況比較，所有給藥組均與陰性組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），同時蟾皮中劑量組和蟾酥中劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表6。

3 討論

本品性狀為深灰色半固體，pH值介于5～7之間，與人體皮膚值相近，有利于延長藥物在皮膚表面的滯留時間。在定性定量測定中，均采以甲醇為溶劑將凝膠劑溶解分散后加熱回流，過膜、測定，使主藥盡可能溶出，同時可去除輔料的干擾。薄層色譜鑒別參照《中國藥典》2015年版（四部）通則0502薄層色譜法試驗華蟾酥毒基和酯蟾毒配基采用環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（4∶3∶3）展開，10%硫酸乙醇溶液顯色，紫外365 nm處分別顯示黃色和藍紫色熒光，陰性無干擾。采用HPLC測定制劑中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量，色譜條件為色譜柱：kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（瑞典）；流動相：乙腈（A）-水（B）（48︰52）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：296 nm。在上述實驗條件下，測得凍干蟾皮凝膠劑中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基總量不低于380 μg/g，該測定方法簡便易行，精密度、重現(xiàn)性良好。

蟾酥中以華蟾酥毒基和酯蟾毒配基為代表的脂溶性成分，具有較強的抗腫瘤活性，本課題采用蟾皮和蟾酥分別制成凝膠劑給藥后，發(fā)現(xiàn)在相同含量的有效成分下，兩者對腫瘤的抑制率不存在顯著性差異。腹腔注射陽性藥環(huán)磷酰胺抑瘤率較差，可能原因為本課題采用背部皮下接種，腹腔注射為全身作用，對于局部治療效果較差。脾臟和胸腺是機體重要的免疫器官，二者對細胞毒藥物敏感性較高，在化療藥物作用下明顯萎縮，其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生器質(zhì)性損傷，是評價藥物療效的重要免疫指標。

本實驗由于條件限制未對凝膠劑微生物限定和皮膚刺激性進行研究，課題組將繼續(xù)完善制劑的相關(guān)研究，同時僅完成初步藥效學研究，后續(xù)將進行細胞水平和整體水平完整的藥效學研究，為后續(xù)的新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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