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    葛胺酮-大豆卵磷脂復(fù)合物的制備、表征及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

    2018-06-13 03:34:22鄒云彭彭濤溫曉雪王剛孫云波劉曙晨高月張首國王林1
    生物技術(shù)通訊 2018年3期
    關(guān)鍵詞:卵磷脂復(fù)合物摩爾

    鄒云彭,彭濤,溫曉雪,王剛,孫云波,劉曙晨,高月,張首國,王林1,

    1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124;2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850

    葛根素(puerarin)是從葛根中提取的一種異黃酮碳苷類化合物[1],具有顯著的抗心肌缺血[2]和抗腦缺血作用[3]。但是葛根素水溶性差、滲透性差,且易出現(xiàn)溶血副作用,極大地限制了其臨床應(yīng)用。3′-(二甲基氨基)甲基葛根素鹽酸鹽(葛胺酮,G20)是由本課題組研發(fā)的葛根素衍生物。其抗心肌缺血和腦缺血作用強(qiáng)于葛根素,且無溶血副作用[4-5]。但由于G20脂溶性較差且口服生物利用度低,極大地影響了其在臨床上的優(yōu)勢(shì)。

    大豆卵磷脂與藥物分子的絡(luò)合技術(shù)應(yīng)用廣泛,可以改善藥物口服吸收。大豆卵磷脂是一種具有兩親性的特殊載體,是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的主要成分之一。它不僅可以提高難溶性藥物的溶解度及藥物釋放速率,而且能增強(qiáng)藥物的膜滲透性[6]。意大利學(xué)者在1987年首次制備多酚類化合物的卵磷脂復(fù)合物,該復(fù)合物顯著提高了多酚類化合物的口服生物利用度[7]。迄今已有大黃酚[8]、沒食子酸[9]、黃芩苷[10]、氧化苦參堿[11]等多種中藥單體制備卵磷脂復(fù)合物,改善了活性中藥成分在生物體內(nèi)的吸收。在此,我們采用L9(34)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化G20-大豆卵磷脂復(fù)合物的制備方案,對(duì)所得復(fù)合物進(jìn)行X線衍射分析,評(píng)估大鼠口服G20和G20-大豆卵磷脂復(fù)合物后的生物利用度

    1 材料

    雄性SD大鼠,體重(250±15)g,購自軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;G20由本實(shí)驗(yàn)室合成,HPLC檢測(cè)含量高于99%;對(duì)羥基苯甲醛、檸檬酸、大豆卵磷脂購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純產(chǎn)品;Agilent1100高效液相色譜儀為安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)品;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 卵磷脂復(fù)合物的制備

    取 G20(100.0mg,217.8 μmol)、大豆卵磷脂[169.9mg,217.8μmol(天然卵磷脂的平均相對(duì)分子質(zhì)量為780,此時(shí)G20與大豆卵磷脂的摩爾比為1∶1)]加到2.5mL有機(jī)溶劑中,30℃攪拌2 h,濃縮得到淡黃色固體,加入氯仿溶解該固體,抽濾除去沒有反應(yīng)的G20,再濃縮干燥過夜,得到G20-大豆卵磷脂復(fù)合物。

    2.2 復(fù)合率的測(cè)定

    G20極易溶于水,難溶于氯仿,而大豆卵磷脂和G20-大豆卵磷脂復(fù)合物都易溶于氯仿。在G20和大豆卵磷脂反應(yīng)后,濃縮得到淡黃色固體,用氯仿溶解該固體中的大豆卵磷脂及所生成的卵磷脂復(fù)合物,抽濾得到沉淀,反復(fù)用氯仿洗滌沉淀,干燥后稱重,該沉淀即為不溶于氯仿的G20。按照下式計(jì)算藥物與卵磷脂的復(fù)合率:

    2.3 單因素考察

    2.3.1 選擇最佳反應(yīng)溶劑 選取甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、氯仿、乙酸乙酯、二氧六環(huán)作為反應(yīng)溶劑,其他反應(yīng)條件如2.1(藥脂摩爾比為1∶1,反應(yīng)溫度為30℃,反應(yīng)時(shí)間為2h,反應(yīng)溶劑為2.5mL)。以G20-大豆卵磷脂復(fù)合物的復(fù)合率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),尋找最佳反應(yīng)溶劑。結(jié)果顯示,上述溶劑的復(fù)合率分別為(23.03±2.56)%、(46.07±3.26)%、(26.07±1.46)%、(28.83±0.60)%、(23.73±1.27)%、(18.97±1.66)%、(34.03±2.82)%(n=3)??梢钥闯鲆砸掖紴榉磻?yīng)溶劑的復(fù)合率最高,故反應(yīng)溶劑選擇乙醇。

    2.3.2 選擇最佳藥脂摩爾比 研究不同藥脂摩爾比(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3)對(duì) G20-大豆卵磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響,選定乙醇為反應(yīng)溶劑,其他反應(yīng)條件如2.1。復(fù)合率分別為(18.20±0.21)%、(27.57±0.10)%、(57.00±0.06)%、(54.73±0.14)%(n=3)??梢钥闯?,隨著大豆卵磷脂比例的提高,復(fù)合率大幅度上升,但是當(dāng)藥脂摩爾比為1∶2時(shí),繼續(xù)增加大豆卵磷脂比例,復(fù)合率沒有進(jìn)一步提高。大豆卵磷脂含量過高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物的黏度增大,因此選取藥脂摩爾比為1∶2。

    2.3.3 選擇最佳溶劑量 研究不同溶劑體積(2.5、5、10、15、20、30、40、60mL)對(duì)G20-大豆卵磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響,選定乙醇為反應(yīng)溶劑,其他反應(yīng)條件如2.1。復(fù)合率分別為(34.27±0.24)%、(37.80±0.04)%、(55.27±0.20)%、(61.70±0.08)%、(71.70±0.12)%、(75.47±0.10)%、(80.03±0.13)%、(81.33±0.10)%(n=3)??梢钥闯觯S著乙醇體積的增大,復(fù)合率大幅度上升,當(dāng)無水乙醇為60mL時(shí)復(fù)合率最大。

    2.3.4 選擇最佳反應(yīng)時(shí)間 研究不同反應(yīng)時(shí)間(2、3、4、5h)對(duì) G20-大豆卵磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響,選定乙醇為反應(yīng)溶劑,其他反應(yīng)條件如2.1。 復(fù) 合率 分 別 為(27.73±0.09)%、(28.33±0.06)%、(27.17±0.13)%、(32.17±0.12)%(n=3)。可以看出,反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合物復(fù)合率的影響較小,為了節(jié)省反應(yīng)時(shí)間,選取反應(yīng)時(shí)間為2h。

    英格曼神甫走上前,給每個(gè)女人劃十字祈求幸運(yùn)。輪到趙玉墨了,她嬌羞地一笑,屈了一下膝蓋,惟妙惟肖的一個(gè)女學(xué)生。

    2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案

    通過單因素考察可以看出,對(duì)復(fù)合率影響較大的實(shí)驗(yàn)因素有藥脂摩爾比、溶劑量、反應(yīng)溫度,而反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率影響不大。采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表,以復(fù)合率為指標(biāo),對(duì)藥脂摩爾比(A)、溶劑量(B)、反應(yīng)溫度(C)進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化[12],反應(yīng)時(shí)間均為2h。采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1,方差分析見表2。3種實(shí)驗(yàn)因素對(duì)復(fù)合率的影響順序?yàn)樗幹柋龋ˋ)>溶劑量(B)>反應(yīng)溫度(C),藥脂摩爾比對(duì)復(fù)合率的影響最大。最佳實(shí)驗(yàn)方案確定為A2B3C3,即G20與卵磷脂的投料摩爾比為1∶1.5,溶劑量為40mL,反應(yīng)溫度為50℃。

    2.5 最佳反應(yīng)條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

    根據(jù)正交設(shè)計(jì)結(jié)果,采用最佳工藝制備G20-大豆卵磷脂復(fù)合物,測(cè)得3批樣品的復(fù)合率均為100%,說明該制備工藝穩(wěn)定可靠,重現(xiàn)性強(qiáng)。

    2.6 X線衍射分析(XRD)

    如圖1所示,用X線衍射法評(píng)價(jià)G20在G20-大豆卵磷脂復(fù)合物中的物理狀態(tài)。G20粉末的XRD圖存在特征結(jié)晶衍射峰,而大豆卵磷脂的XRD圖呈現(xiàn)一個(gè)寬峰,沒有任何特征結(jié)晶衍射峰存在。G20與大豆卵磷脂的物理混合物(藥脂的摩爾比為1∶1.5)的XRD圖存在明顯的G20的特征結(jié)晶衍射峰,這說明G20以晶體形式存在于該物理混合物中。而在G20-大豆卵磷脂復(fù)合物的XRD圖中,不存在任何G20的特征結(jié)晶衍射峰,這說明G20-大豆卵磷脂復(fù)合物中沒有任何G20晶體存在。在G20-大豆卵磷脂復(fù)合物中,G20可能以分子或非晶體的形式存在,G20與卵磷脂復(fù)合物存在相互作用力,如范德華力、偶極-偶極相互作用、氫鍵[13]。

    2.7 藥動(dòng)學(xué)研究

    2.7.1 灌胃供試液配制 取G20200.0mg,加入8mL超純水,超聲波2min,配制成含G2025 mg/mL的G20溶液。取G20-大豆卵磷脂復(fù)合物680.0mg,加入8mL0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,超聲波2min,配制成含G2025mg/mL的G20-大豆卵磷脂復(fù)合物混懸液。

    表1 采用L9(34)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化G20卵磷脂復(fù)合物制備方案

    表2 方差分析

    圖1 大豆卵磷脂(A)、G20(B)、物理混合物(C)和G20-大豆卵磷脂復(fù)合物(D)的XRD圖

    2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與方法學(xué)考察 精密吸取150μL血漿樣品于5mLEP管中,加入7.5μL適當(dāng)濃度的G20溶液和7.5μL320μg/mL對(duì)羥基苯甲醛溶液(內(nèi)標(biāo)),簡單振搖后加入135μL 6%高氯酸水溶液沉淀蛋白,渦旋振蕩3min后超聲波5min,9500r/min離心15min,吸取全部上清液,過 0.45 μm 微孔濾膜,得到 0.1、1、4、10、40、100、140、200 μg/mL的G20血漿溶液(該溶液中內(nèi)標(biāo)物濃度為8μg/mL)。

    HPLC采用Venusil-ASBC18色譜柱(250mm×4.6 mm,5 μm),柱溫25℃,流動(dòng)相為甲醇-水(含0.2%檸檬酸,20∶80),檢測(cè)波長250nm,進(jìn)樣量60 μL。以G20與對(duì)羥基苯甲醛峰面積之比為縱坐標(biāo)(AG20/A內(nèi)標(biāo))、G20濃度為橫坐標(biāo)(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程AG20/A內(nèi)標(biāo)=0.24C+0.014(r=0.999949)。

    配制1、10、100μg/mL的質(zhì)控樣品各5份,按上述血漿樣品處理方法處理,每天HPLC測(cè)定一次,連續(xù)測(cè)定3d,考察日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果表明,3種質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度RSD(n=5)分別為4.42%、2.87%、1.10%,日間精密度RSD(n=15)分別為4.07%、3.10%、2.95%,回收率(n=5)分別為(106.58±4.71)%、(99.55±2.85)%、(98.11± 1.08)%。長期凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示將G20血漿樣品于-20℃儲(chǔ)存15d,G20血漿樣品穩(wěn)定性好。

    2.7.3 G20與G20-大豆卵磷脂復(fù)合物的大鼠生物利用度測(cè)定 將12只SD大鼠隨機(jī)分為2組,每組6只,實(shí)驗(yàn)前禁食12h,分別灌胃給予50mg/mL(按G20量計(jì)算)G20和G20-大豆卵磷脂復(fù)合物,灌胃后 5、15、30、45、60、90min和2、3、5、8、24h用肝素鈉潤洗過5mLEP管,尾靜脈取血0.6mL(約15滴),輕輕振搖后1980r/min離心15 min得到含藥血漿[14],-20℃凍存待用。

    精密吸取150μL上述含藥血漿至5mL離心管中,加入15μL160μg/mL對(duì)羥基苯甲醛溶液,簡單振搖后加入135μL6%高氯酸水溶液沉淀蛋白,渦旋振蕩3min后超聲波5min,9500r/min離心15min,吸取全部上清液,過0.45μm微孔濾膜,得到待測(cè)樣品稀釋液(含內(nèi)標(biāo)物濃度為8μg/mL),取稀釋液60μL進(jìn)樣分析。

    藥時(shí)曲線如圖2,相應(yīng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。當(dāng)SD大鼠灌胃給予G20及其卵磷脂復(fù)合物后,血藥濃度達(dá)峰時(shí)間(Tmax)從(0.555±0.473)h顯著增加到(1.250±0.250)h(P<0.05),說明制成磷脂復(fù)合物之后,G20的作用時(shí)間延長。藥時(shí)曲線下面積(AUC)由(3.139±0.844)μg/(h·mL)增大到(5.025±0.170)μg/(h·mL)(P<0.01)。G20-大豆卵磷脂復(fù)合物的AUC是G20的1.6倍,表明采用磷脂復(fù)合物技術(shù)可以顯著提高G20的口服生物利用度。

    3 討論

    正交設(shè)計(jì)是一種系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)方法,它能最大限度地提高測(cè)試覆蓋率并減少測(cè)試的數(shù)量[15],適用于優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。Liu等[16]通過L9(34)正交設(shè)計(jì)考察大豆卵磷脂的濃度、3種配料(大豆卵磷脂、膽固醇和脫氧膽酸鈉)比例對(duì)齊墩果酸脂質(zhì)體包封率的影響,優(yōu)化了齊墩果酸脂質(zhì)體制備方案,使藥物包封率達(dá)到90%以上。本研究以G20與大豆卵磷脂的復(fù)合率為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),使復(fù)合率達(dá)到100%。該制備工藝條件穩(wěn)定,操作簡便,所得卵磷脂復(fù)合物為粉末狀,易于操作。

    一些多酚類、黃酮類和萜類等植物活性成分因膜透性差、口服生物利用度低而使其應(yīng)用受到限制[17]。卵磷脂與這些植物成分進(jìn)行絡(luò)合,可以改善其生物利用度,通過磷脂復(fù)合物獨(dú)特的釋藥模式延長藥物作用時(shí)間[18]。在本研究中,SD大鼠分別灌胃給予G20及其卵磷脂復(fù)合物,與G20相比,其卵磷脂復(fù)合物的口服生物利用度提高了160%。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研發(fā)G20口服制劑提供參考。

    圖2 G20和G20-大豆卵磷脂復(fù)合物的藥時(shí)曲線

    表3 G20和G20-大豆卵磷脂復(fù)合物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(x±s,n=6)

    參考文獻(xiàn)

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