Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原表位嵌合蛋白的免疫學研究

楊筱舟，王晶，夏文躍，潘小霞，趙冰心，滕玉梅，文喻玲，陳元鼎

1.中國醫(yī)學科學研究院＆北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明 650118；2.云南民族大學 化學與生物技術(shù)學院，民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650118

輪狀病毒（rotavirus，RV）是人和動物腹瀉的主要病原體，為正二十面體顆粒，含3層病毒衣殼，屬于呼腸病毒科（Reovirudae）。RV一種分節(jié)段、無包膜的由11個雙鏈RNA片段組成的病毒，可編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白（VP）和6個非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）[1]。根據(jù)組抗原蛋白VP6的血清型可將現(xiàn)有RV分為A～H共8個組，A、B、C、H組的RV可感染人類[2]。A組RV是引起嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體。根據(jù)非糖基化刺突蛋白VP4和糖蛋白VP7編碼基因的同源性差異，可將A組RV進行基因分型，目前共有27個G（VP7）型和37個P型（VP4）[3]。VP6是RV組抗原蛋白，最保守且最豐富，約占病毒結(jié)構(gòu)蛋白總量的39%[4]。

至今尚無治療RV感染的特效藥物，疫苗仍是預防RV感染的最有效方法。作為全球首個口服輪狀病毒疫苗，恒河猴人重組輪狀病毒疫苗于1998年在美國上市，但由于存在腸套疊風險，一年后退出市場。隨后使用最多的是RV減毒活疫苗，如英國產(chǎn)Rotarix疫苗，它是由G1P［8］病毒株所制備的口服減毒活疫苗，兒童接種Rotarix疫苗后抗輪狀病毒IgA抗體陽轉(zhuǎn)率在新加坡地區(qū)可高達93.0%，在印度地區(qū)則較低，最高達67.4%[5]。Rotarix對不同型別輪狀病毒的有效性存在差異，比如對G1野生型的平均有效性達64.1%，對非G1型輪狀病毒的平均有效性達59.7%，對P［4］型的平均有效性達70.9%，對P［6］型的平均有效性達55.2%，對P［8］型的平均有效性達59.1%[6]。此外還有美國產(chǎn)的RotaTeq疫苗，它是人牛（WC3）重配株，含5種重配輪狀病毒的口服減毒活疫苗，其中1個表達人RVP［8］型重配株，4個表達人RV（G1-G4型）重配株[7]，美國及芬蘭的兒童在接種RV5疫苗的抗輪狀病毒IgA陽轉(zhuǎn)率可高達95.5%，在非洲的效率較差，最高可達82.5%[8-9]。美國利用VDS分析方法對RotaTeq進行安全檢測后，發(fā)現(xiàn)服用RotaTeq兒童的腸套疊及其他不良反應(yīng)發(fā)生率與正常組比較未見顯著差異[10]。目前，我國自己生產(chǎn)的RV口服疫苗是蘭州生物制品研究所的羅威特疫苗（LLR）。LLR是由羔羊體內(nèi)血清型為G10P［15］的羊輪狀病毒制備的單價輪狀病毒疫苗，相關(guān)研究顯示其平均保護率僅為76%[11]。RV口服減毒活疫苗雖為人們帶來福音，但同時也存在一定的問題，如疫苗安全性問題，可能會發(fā)生毒株基因重配，從而引起其他疾?。灰呙缥廴締栴}，2010年美國FDA在Rotarix和RotaTeq中發(fā)現(xiàn)了豬圓環(huán)病毒1型的DNA片段[12]；疫苗保護效果問題，不同地區(qū)的保護效果及有效性存在一定的差異，例如Rotarix和RotaTeq在發(fā)展中國家的保護性遠低于發(fā)達國家。

脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus，PV）屬微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），腸道病毒屬（Entero?virus）?；蚪M為正向單鏈RNA，約7.5kb，是由十二個五聚體構(gòu)成的二十面體病毒顆粒[13]，可編碼VP4、VP2、VP3和 VP1共 4個結(jié)構(gòu)蛋白及 2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D共7個非結(jié)構(gòu)蛋白[14]。根據(jù)病毒毒株的不同抗原性，PV被分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等3種血清型，血清型之間無交叉免疫反應(yīng)。人是脊灰病毒惟一的自然宿主，會導致肢體肌肉發(fā)生不對稱弛緩性麻痹，也稱小兒麻痹癥[15-16]。

脊灰病毒引起的脊髓灰質(zhì)炎目前只能通過疫苗進行預防[17]，如口服脊灰減毒活疫苗OPV和滅活疫苗IPV。但隨著OPV的使用，疫苗相關(guān)麻痹性脊髓灰質(zhì)炎（vaccine-associated paralytic po?liomyelitis，VAPP）和疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒（vaccine-derived poliovirus，VDPV）問題隨之出現(xiàn)。VAPP會使因個體差異或具有免疫功能缺陷的接種者在接種過程中產(chǎn)生麻痹型脊灰問題，而VDPV會使已消除脊灰病毒的國家因為繼續(xù)使用OPV而產(chǎn)生疫苗衍生脊灰病毒[18]，進而會產(chǎn)生循環(huán)，形成 cVDPV（circulating vaccine-derived polio?viruses）[19]。IPV一般采用注射形式接種，且不存在上述OPV所引起的疫苗衍生病例，目前較為推廣的是利用Sabin株病毒生產(chǎn)的IPV。

綜上所述，由于現(xiàn)有的RV和PV疫苗都存在一定的弊端，因此研發(fā)新的疫苗是當今趨勢。在此，我們通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建了包含RVVP6和PV3抗原表位1的載體質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達嵌合蛋白，為新型RV、PV疫苗和疫苗載體研究提供了新的方向，并有助于其開發(fā)利用。

1 材料和方法

1.1 材料

用于基因克隆和擴增的大腸桿菌DH5α以及用于蛋白表達的大腸桿菌BL21（DE3）由本實驗室提供；RVSA11株和PVⅢ型457PfizerRS1（PV3）來自世界衛(wèi)生組織（WHO）；表達質(zhì)粒pETL由本實驗室自pET-3a改造而來；豚鼠抗載體蛋白VP6F血清抗體、抗輪狀病毒W(wǎng)a株血清抗體和抗PV3血清抗體由本實驗室制備；限制性內(nèi)切酶、250bpDNA分子量標準和T4DNA連接酶等購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗豚鼠IgG（含輕鏈和重鏈）購自KPL公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購自Sigma公司。

1.2 pETP6F載體蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建

克隆重組人RVTB-Chen株VP6的cDNA，在編碼VP6蛋白結(jié)構(gòu)表面位置插入6個內(nèi)切酶位點（SacⅠ、BspT104、KpnⅠ、BlnⅠ、SacⅡ和XhoⅠ），得到含6個插入位點I1、I2、I3、I4、I5、I6的重組載體蛋白VP6F（380氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為43200）的編碼DNA。將重組載體蛋白VP6F編碼DNA插入空載體質(zhì)粒pETL的NdeⅠ/BamHⅠ克隆位點，構(gòu)建攜帶載體蛋白VP6F編碼DNA的重組表達質(zhì)粒pETP6F。

Aim: The aim of the study was to perform a comparative evaluation of the use of various methods of reconstructive assistance in the repair of the femoral-tibial segment in patients with peripheral arterial disease.

1.3 重組抗原表位

選取PV3中和位點1（NAg1）的氨基酸序列作為外源抗原表位（命名為PV3N1），其基因序列為GAGGTGGACAATGAACAAACCACCCGGGCACAGA AG，對應(yīng)的氨基酸序列為EVDNEQPTTRAQK。人工合成編碼抗原表位PV3N1的互補核苷酸引物，兩端引入XhoⅠ酶切位點，上游引物為PV3/N1-308X-F：TCGAGGTGGACAATGAACAACCAACCA CCCGGGCACAGAAGC，下游引物為PV3/N1-308XR：TCGAGCTTCTGTGCCCGGGTGGTTGGTTGTTCA TTGTCCACC。將設(shè)計合成的互補引物片段進行退火，制備插入片段，并在T4DNA連接酶的作用下，插入VP6F載體蛋白上的I6位點。

1.4 嵌合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將抗原表位嵌合蛋白編碼基因重組連接到pETL質(zhì)粒的NdeⅠ/BamHⅠ克隆位點上，構(gòu)建在VP6F上攜帶PV3抗原表位基因的重組嵌合表達質(zhì)粒pETP6F/PV3N1。經(jīng)雙酶切反應(yīng)鑒定該重組嵌合表達質(zhì)粒連接成功，通過DNA測序確定目的基因正確完整。

1.5 重組嵌合蛋白的表達

將重組質(zhì)粒pETP6F、pETP6F308X/PV3V1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進行表達，并利用堿裂解法提取大腸桿菌DH5α中的質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定及DNA測序確定。再將重組質(zhì)粒pETP6F、pETP6F308X/PV3V1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上于37℃表達。

1.6 重組嵌合蛋白的SDS-PAGE檢測及純化

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)液于4℃、4000r/min離心8min，菌體沉淀用超聲波裂解緩沖液［200mmol/LNaCl，50mmol/LTris（pH7.5），5%甘油，5%Triton X-100，2mmol/LEDTA（pH8.0），0.2% β巰基乙醇］懸浮，于冰水浴中超聲波裂解30min，功率30%，裂解液經(jīng)4℃、12000r/min離心30min，沉淀（包涵體）蛋白溶于8mol/L尿素，分裝，保存待檢。

溶解于8mol/L尿素中的包涵體蛋白通過10%SDS-PAGE檢測及分離純化（電壓130V，電流150mA，功率90W）。約電泳6h，溴酚藍跑到膠面的最下端，取下凝膠，放入150mmol/L KCl中顯色，當凝膠上出現(xiàn)明顯條帶時切下重組蛋白目的條帶，放入12%SDS-PAGE的凝膠柱中電泳（20mA，4℃，15h），富集到與凝膠柱相連的盛有不含SDS的電泳液的回收杯中，收集蛋白回收液，加入疊氮化鈉，分裝，-20℃保存。

1.7 Western印跡

用載體蛋白和PV免疫動物血清抗體對重組蛋白進行Western印跡檢測。用半干轉(zhuǎn)印法將SDS-PAGE分離的凝膠上的嵌合蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（恒壓15V，時間30min），用5%脫脂奶粉（TBS稀釋）于4℃封閉過夜，加入抗VP6F或抗PV豚鼠免疫血清抗體（一抗，1∶500稀釋），37℃孵育 1.5h，TBS-T（加入 0.05%Tween-20的TBS）漂洗5次，每次5min，加入HRP標記的羊抗豚鼠 IgG（二抗，1∶2000稀釋），37℃孵育 1h；TBS-T漂洗5次，每次5min，將膜放入DAB溶液（10mg/mL，TBS稀釋，使用前加入30%過氧化氫溶液）顯色，蒸餾水漂洗終止顯色，拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組嵌合蛋白表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建

用分子克隆手段構(gòu)建載體蛋白VP6F表達質(zhì)粒pETP6F及嵌合蛋白表達質(zhì)粒pETP6F/PV3N1，經(jīng)BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，分別在相應(yīng)位置可見約370和410bp的條帶（圖1），與預期相符，表明嵌合蛋白基因中成功插入PV3NAg1處的抗原表位基因。經(jīng)DNA測序，確認所構(gòu)建的質(zhì)粒核苷酸序列完整正確。

2.2 重組嵌合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達和純化

重組表達的載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1經(jīng)SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍染色后觀察其蛋白相對分子質(zhì)量，結(jié)果如圖2。

2.3 Western印跡

載體蛋白VP6F免疫的豚鼠血清抗體能特異性結(jié)合載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3A）；輪狀病毒W(wǎng)a株免疫的豚鼠血清抗體能特異性結(jié)合載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3B）；PV3免疫的豚鼠血清抗體只能特異性結(jié)合嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3C）；PV1免疫的豚鼠血清抗體無法特異性結(jié)合嵌合蛋白6F/PV3N1和載體蛋白VP6F（無條帶，圖未示）。

3 討論

嵌合基因是指通過基因重組技術(shù)將來源不同的DNA序列重組而成的人造基因，將其通過載體轉(zhuǎn)入宿主細胞表達產(chǎn)生的融合蛋白稱為嵌合蛋白。在構(gòu)建嵌合蛋白的過程中，我們首先選擇A組人RVTB-Chen株的組抗原蛋白VP6的編碼基因進行克隆，因為VP6蛋白是RV中含量最高、保守性最強的蛋白，在哺乳動物中其同源性可高達87%～99%[20]，所以用它制備疫苗會產(chǎn)生較強的免疫原性。將VP6與空載體pETL重組后構(gòu)建載體蛋白VP6F，再將PV3抗原表位NAg1插入載體蛋白VP6F，構(gòu)建嵌合蛋白載體pET6F/PV3N1，將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行大量表達，獲得嵌合蛋白6F/PV3N1。通過Western印跡可觀察到6F/PV3N1可以與豚鼠抗載體蛋白VP6F血清抗體、抗輪狀病毒W(wǎng)a株血清抗體和抗PV3血清抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，但不能與抗PV1血清抗體產(chǎn)生反應(yīng)，證明了6F/PV3N1的免疫原性和特異性，以及PV不同血清型間不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。該實驗為RV和PV疫苗的發(fā)展提供了一定的基礎(chǔ)。

圖1 重組質(zhì)粒BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳M：250bpDNAmarker；1：pETP6F；2：pETP6F/PV3N1

圖2 載體蛋白和重組嵌合蛋白的SDS-PAGE

圖3 VP6F（A）、輪狀病毒W(wǎng)a株（B）、PV（C）免疫豚鼠血清抗體的Western印跡