人甲狀腺乳頭狀癌中前列腺素E2受體及其下游信號分子的表達(dá)及意義

胡芳 闊依旦·圖亞 韋曉虹 劉雪婷 羅順葵 孫遼中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科（廣東珠海 59000）；新疆自治區(qū)人民醫(yī)院（烏魯木齊80000）；深圳市第二人民醫(yī)院（廣東深圳58000）

甲狀腺乳頭狀癌（papillarythyroid carcinoma，PTC）是我國增長速度最快的惡性腫瘤之一［1-2］。目前有關(guān)前列腺素受體及其下游信號分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究得到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注［3］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)：COX?2在人PTC組織中表達(dá)明顯增加，其主要產(chǎn)物PGE2的合成也明顯增加［4］，PGE2主要通過其EP受體發(fā)揮生物學(xué)作用。但目前EP受體在PTC中的表達(dá)鮮有報(bào)道。本研究通過分析癌旁正常甲狀腺組織（adjacent normal tissues，ANT），結(jié)節(jié)性甲狀腺組織（nodular goiter，NG），PTC組織EP受體及其下游信號分子的表達(dá)，初步探討PGE2/EPs在PTC發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例及標(biāo)本 留取2013年8月至2014年2月中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院普外科甲狀腺結(jié)節(jié)全切或次全切除術(shù)后的新鮮甲狀腺組織。從中選取經(jīng)病理結(jié)果確認(rèn)的甲狀腺乳頭狀癌組織15例（PTC）及其癌旁甲狀腺組織（ANT），結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織15例（NG），用于RT?qPCR檢測，全部病例術(shù)前均無化療、放療及免疫治療史。同時(shí)收集患者術(shù)后的石蠟標(biāo)本，切片厚度為5 μm，用于免疫組化。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)過中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意審批。

1.2 主要試劑 RT?qPCR引物設(shè)計(jì)和合成（Invit?rogen，USA）；TRIzol RNA 提取試劑（Invitrogen，USA）；PrimeScript RT Reagent Kit Perfect Real Time試劑盒（TaKaRa，日本）；EP4受體多克隆抗體（Cayman，USA）；兔多克隆抗體 PKAα+β及Epac1（Abcam，USA）：兔多克隆抗體 Phospho?AMPKα（Cell Signaling，USA）。即用型高效免疫組化二抗試劑盒（Thermo Scientific，USA）。

1.3 RT?qPCR 新鮮甲狀腺組織使用Trizol研磨，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物序列見［4］。使用下列擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共循環(huán)40次，95℃反應(yīng)5 s，65℃反應(yīng)1 min。使用β?actin作為內(nèi)參。每個(gè)樣本分別作3次重復(fù)，使用2-ΔΔCt公式進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。

1.4 免疫組化 組織玻片經(jīng)脫蠟水化，EDTA（pH=8.0）溶液微波爐高溫修復(fù)，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵一抗4℃過夜，二抗孵育后DAB顯色3 min，蘇木素染核，PBS返藍(lán)，以結(jié)腸癌組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。利用Zeiss正置熒光顯微鏡觀察結(jié)果并用其彩色CCD數(shù)碼相機(jī)拍照，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域進(jìn)行拍攝，放大倍數(shù)選200×，所有照片均在同一條件下一次性拍攝完成；染色強(qiáng)度計(jì)算：用image?pro plus 6.0軟件對每張免疫組化照片進(jìn)行平均光密度計(jì)算，陽性表達(dá)越強(qiáng)則光密度數(shù)值越高。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用方差分析和t檢驗(yàn)，當(dāng)數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布時(shí)用“中位數(shù)（四分位間距）”表示，采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC患者臨床資料 甲狀腺乳頭狀癌PTC組男2例，女13例，平均（36.17±13.09）歲。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫NG組男3例，女13例，平均（41.63±13.99）歲。兩組性別構(gòu)成及年齡均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 EP4mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織表達(dá)上調(diào) EP1和EP3的mRNA表達(dá)在3組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.276，P=0.655）。與ANT相比，PTC及NG組EP2的mRNA表達(dá)明顯增加（P=0.001，P=0.000），但EP2的mRNA表達(dá)在PTC及NG組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.211）。EP4的mRNA表達(dá)在PTC組中的表達(dá)較ANT和NG組均高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015，P=0.035），而在ANT組和NG組間的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.549）。見圖1。

圖1 ANT，NG及PTC甲狀腺組織中EPs的表達(dá)Fig.1 mRNA expression of EPs in thyroid glands of ANT，NG and PTC

2.3 EP4及其下游因子PKA、Epac和AMPK在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)上調(diào) EP4受體及AMPK蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá)，PTC組中表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PKA及Epac主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，PTC組中表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 EP4，PKA，Epac和AMPK在甲狀腺乳頭狀癌組織中的免疫組化結(jié)果Fig.2 Immunohistochemical resultsof EP4，PKA，Epac and AMPK in thyroid papillary carcinoma

3 討論

本研究結(jié)果顯示4種EP受體在甲狀腺組織中均有表達(dá)，但EP4 mRNA在PTC中表達(dá)率最高，這一結(jié)果提示EP4是與PTC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最密切的EP受體。EP4受體主要通過結(jié)合Gs促進(jìn)cAMP生成，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用［5］。cAMP作為細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的第二信使，通過其下游主要信號分子PKA、Epac以及AMPK介導(dǎo)的信號通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等病理生理過程［6］。

筆者研究發(fā)現(xiàn)PKA蛋白在PTC中表達(dá)明顯高于ANT及NG組織。PKA是一種cAMP依賴的蛋白激酶，主要介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。PKA分為4型：RIa，RIβ，RIIa，and RIIβ［7］。不同亞型在細(xì)胞增殖、分化中表達(dá)存在差異［8］。FERRERO等［9］發(fā)現(xiàn)PKARIIβ在分化型甲狀腺癌及未分化型甲狀腺癌中表達(dá)明顯高于ANT組織，PKARIa蛋白僅在未分化型甲狀腺癌中表達(dá)。我們研究檢測的是PKA（α+β），關(guān)于各個(gè)亞型在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)的情況如何，以及具體通過哪種亞型介導(dǎo)其作用，有待進(jìn)一步深入研究。

筆者的研究結(jié)果顯示Epac1蛋白在PTC中表達(dá)明顯高于NG及ANT組織。甲狀腺組織中主要表達(dá)Epac1，且不同類型甲狀腺腫瘤細(xì)胞中Epac1表達(dá)存在差異［10］。BROECKER等［10］發(fā)現(xiàn)：相比濾泡狀PTC，典型和高柱狀PTC中Epac1呈中等表達(dá)；而與良性甲狀腺腺瘤對比，Epac1在PTC相對低表達(dá)。在MISRA等［11］的研究中發(fā)現(xiàn)Epac1可以誘導(dǎo)前列腺癌的細(xì)胞增殖，而這一過程是由B?Raf/ERK及mTOR信號通路所介導(dǎo)。在關(guān)于小鼠肺上黑色素瘤移植瘤的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Epac通過硫酸肝素相關(guān)機(jī)制來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移［12］。而在PTC中，Epac通過哪些信號途徑參與其發(fā)生、發(fā)展過程尚未清楚，有待進(jìn)一步研究。

筆者研究結(jié)果顯示：AMPK蛋白在PTC中表達(dá)明顯高于NG及ANT組織。同樣VIDAL等［13］人發(fā)現(xiàn)AMPK在PTC中是高表達(dá)的，AMPK在PTC及ANT中主要是在細(xì)胞質(zhì)中染色，在細(xì)胞核及細(xì)胞膜中也有部分表達(dá)。這與筆者的研究結(jié)果一致。腫瘤細(xì)胞在不斷增殖分化過程是需要消耗大量ATP，AMPK主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的代謝及能量守恒［14］。關(guān)于AMPK的研究發(fā)現(xiàn)，AMPK的激活可以抑制肺癌、乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞增殖［15-16］。而AMPK抑制腫瘤作用主要通過上游腫瘤抑制酶LKB1激活和磷酸化AMPK繼而抑制下游mTOR來抑制腫瘤［17］，mTOR與BRAFV600E基因突變有關(guān)。而在黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E基因突變導(dǎo)致LKB1/AMPK解偶聯(lián)，進(jìn)而改變與其相關(guān)的mTOR通路［18］。這一研究解釋了甲狀腺乳頭狀癌AMPK高表達(dá)可能，但仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EP4及其下游主要信號分子PKA、Epac和AMPK在PTC中表達(dá)增加，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，為EP4應(yīng)用于甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。

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