去甲烏藥堿對2型心腎綜合征大鼠心腎的保護作用

韋震鳴 傅強 李志樑 吳英智 王慧敏

南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院心血管內(nèi)科（廣州510280）

2型心腎綜合征以慢性心衰合并慢性腎功能不全為特征［1］，血流動力學的紊亂、神經(jīng)激素機制的激活及尿毒癥毒素的聚積，誘發(fā)心肌纖維化及左室重塑，最終心腎共同衰竭，因此改善血流動力學、抑制纖維化是2型CRS防治的關(guān)鍵點［2］。然而，臨床上尚無有效的治療手段，患者病死率較高，需構(gòu)建實驗室動物模型來模擬人類2型CRS的臨床病理生理狀態(tài)，為藥物治療的研究提供基礎(chǔ)。去甲烏藥堿是附子的活性成分，作為β受體部分激活劑，可在一定程度上改善心衰狀態(tài)。此外，還能擴張外周血管，增加冠狀動脈血流，減輕缺血再灌注損傷［3-4］，具有潛在的抗心肌纖維化作用，目前國內(nèi)外尚未有關(guān)于去甲烏藥堿抑制心肌纖維化研究的文獻報道。因此，本實驗采用冠動脈左前降支結(jié)扎術(shù)（CAL）聯(lián)合右腎摘除、左腎動脈分支結(jié)扎的 5/6腎次全切除術(shù)（STNx）［5］構(gòu)建 2型心腎綜合征大鼠模型，誘導心肌纖維化，并通過腹腔注射不同劑量的去甲烏藥堿，觀察心功能和組織學變化，探討去甲烏藥堿能否通過抑制心肌纖維化、減輕左室重構(gòu)，從而改善腎功能，阻斷心腎交互，發(fā)揮心腎同步保護的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量200～250 g［許可證號SCXK（粵）2011-0015，南方醫(yī)科大學實驗動物中心］，獨立通氣籠中適應(yīng)24 h后進行手術(shù)。

1.2 藥物 去甲烏藥堿鹽酸鹽（上海遠慕生物科技有限公司，批號JOT?10761，純度98%）。肌酐、尿素氮、尿蛋白定量試劑盒（知行生物科技有限公司）、大鼠血硫酸吲哚酚ELESA試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司）。

1.3 模型制備及分組 72只SD大鼠5%水合氯醛腹腔注射麻醉，直視下氣管插管，呼吸機（泰盟HX?100E）輔助呼吸，分離左側(cè)胸部皮膚和肌肉，沿胸骨左緣3～4肋間切開，暴露心臟，行左前降支冠狀動脈結(jié)扎術(shù)，誘發(fā)心梗。1周后，行右腎摘除聯(lián)合左腎動脈前上支、前下支及背支結(jié)扎的5/6腎次全切除術(shù)，誘發(fā)腎功能不全。另外8只大鼠以同樣的時間點，僅行心包膜及腎包膜撕開的假手術(shù)，不結(jié)扎。將造模成功的54只大鼠隨機分成模型組（CRS，n=12）、低劑量組（LD，n=13，0.5 mg/kg）、中劑量組（MD，n=13，1.5 mg/kg）、高劑量組（HD，n=16，4.5 mg/kg）。

1.4 藥物配制及給藥 腎次全切除術(shù)后1周開始給藥，去甲烏藥堿用生理鹽水分別配制成0.45%、0.15%、0.05%的溶液，按0.1 mL/kg腹腔注射1次/d，共2周，模型組腹腔注射等量生理鹽水。

1.5 標本收集及指標觀察

1.5.1 超聲心功能分析 給藥2周后異氟烷吸入麻醉下，超聲儀（Vevo 2100 Imaging System）行超聲檢查。

1.5.2 生化指標檢測 稱量體質(zhì)量，麻醉后心尖取血法收集血液標本，離心取血清。代謝籠收集大鼠尿液，記錄24 h尿量，尿液離心后，取上清液。試劑盒檢測血肌酐、血尿素氮、血硫酸吲哚酚、尿肌酐、尿蛋白等。

1.5.3 組織收集及切片染色 取血后取出心臟和腎臟，稱量心臟、左心室和腎臟質(zhì)量，并于4%甲醛中固定、脫水、包埋、切片，按標準步驟進行染色，Image Pro Plus 6.0軟件分析膠原染色面積和熒光強度。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有資料數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0的one?way ANOVA程序進行多組間對比統(tǒng)計分析，計量資料均以±s表示，組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett-T3檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟超聲結(jié)果 相比假術(shù)組，模型組大鼠生存率、EF、FS均顯著降低（P＜0.01），收縮期內(nèi)徑增加約2倍、前壁變薄，Hw/W、LVw/W、LKw/W均顯著增高（P＜0.01）。低、中、高劑量組生存率、EF、FS均有明顯改善趨勢（P＜0.01），收縮期前壁厚度增加63%，Hw/W、LVw/W、LKw/W均有逐漸降低趨勢（表1）。

表1 各組大鼠心臟超聲指標比較Tab.1 Comparison of echocardiogram parameters of different groups ±s

表1 各組大鼠心臟超聲指標比較Tab.1 Comparison of echocardiogram parameters of different groups ±s

注：EF，射血分數(shù)；FS，左室短軸縮短率；LVIDs，左室收縮期內(nèi)徑；LVAWs，左室收縮期前壁厚度；Hw/W，心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比；LVw/W，左室質(zhì)量/體重比；LKw/W，左腎質(zhì)量/體質(zhì)量比；與假術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 例數(shù)EF（%）FS（%）LVIDs（mm）LVAWs（mm）Hw/W（mg/g）LVw/W（mg/g）LKw/W（mg/g） 生存率（%）假術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組8 7 9 9 1 3 77.43±1.89 30.96±2.38**43.09±2.15*45.39±1.99*53.48±2.12**47.55±1.81 16.94±1.29**23.16±1.43*23.86±1.15*28.03±1.04**3.63±0.20 7.26±0.10**6.78±0.18 6.49±0.18*5.69±0.20**2.58±0.08 1.31±0.07**1.38±0.11 1.53±0.08*2.13±0.12**2.76±0.07 5.07±0.17**4.41±0.10*4.62±0.17*4.01±0.19**1.80±0.08 3.46±0.20**2.56±0.18*2.59±0.17*2.30±0.10**2.94±0.05 5.56±0.18**4.93±0.15*4.50±0.22*4.02±0.18**100.00 58.33 69.23 69.23 81.25

2.2 腎功能指標 相比假術(shù)組，模型組Bcr、BUN、24 h Upro、IS明顯升高（P＜0.01），Ucr、24 h Ccr明顯降低（P＜0.01）。低、中、高劑量組Bcr、BUN、24 h Upro、IS水平有逐漸降低趨勢，Ucr、24 h Ccr明顯升高（P＜0.01），腎功能呈好轉(zhuǎn)趨勢（表2）。

2.3 心肌MASSON染色分析 相比假術(shù)組，模型組心肌膠原面積（藍色部分）明顯增大（P＜0.01），結(jié)構(gòu)紊亂、維斷裂、間隙增寬，連續(xù)性差。低、中、高劑量組膠原面積比例逐漸下降（P＜0.01），結(jié)構(gòu)逐漸整齊，連續(xù)性變好（圖1）。

2.4 心肌免疫熒光染色 相比假術(shù)組，模型組CollagenⅠ和TGF?β熒光強度明顯增高（P＜0.01），可見明顯大塊狀熒光染色區(qū)域。低、中、高劑量組CollagenⅠ和TGF?β熒光強度呈逐漸減弱趨勢（P＜0.01），熒光由塊狀逐漸變成散在點狀（圖2、3）。

3 討論

動物模型的構(gòu)建是目前心腎綜合征研究的難點和關(guān)鍵手段，而國內(nèi)外可用的2型CRS大鼠模型非常少。因此，本實驗嘗試采用冠動脈左前降支結(jié)扎術(shù)聯(lián)合右腎摘除、左腎動脈分支結(jié)扎的5/6腎次全切除術(shù)構(gòu)建2型心腎綜合征大鼠模型，成功誘導了心肌纖維化，縮短了造模周期，在造成慢性心腎功能損傷的基礎(chǔ)上保持了器官的完整性。超聲和生化指標結(jié)果顯示模型組心腎功能均顯著降低，心肌纖維化面積增大，纖維因子Collagen I和TGF?β表達顯著增高。符合2型CRS病理生理狀態(tài)，是較為理想的研究2型CRS的動物模型。

表2 各組大鼠生化指標與體質(zhì)量比Tab.2 Comparison of biochemical indicator of different groups ±s

表2 各組大鼠生化指標與體質(zhì)量比Tab.2 Comparison of biochemical indicator of different groups ±s

注：與假術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 例數(shù) 體質(zhì)量（g）Bcr（μmol/L）Ucr（μmol/L）24 h Ccr（mL/d）BUN（mmol/L）24 h Upro（mg/d）IS（pg/mL）假術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組8 7 9 9 1 3 296±7.96 307±17.46**280±6.15*279.7±11.71 286±13.08 23.33±0.95 74.90±6.44**73.56±6.35*63.32±2.66**62.35±3.14**253.12±39.54 18.06±2.30**30.02±5.74*33.20±4.58*82.94±24.23**0.282±0.072 0.029±0.013**0.033±0.008 0.039±0.009*0.067±0.03**3.65±0.23 12.64±1.54**9.04±0.76*7.78±0.43**5.27±0.36**7.28±0.99 17.49±1.92**10.60±0.64*9.52±1.67**8.64±0.79**102.06±12.39 151.02±7.81**136.65±1.59 133.05±10.52*131.91±6.33*

圖1 各組大鼠心肌MASSON染色（×200）Fig.1 Heart tissue with Masson staining of different groups（× 200）

圖2 各組大鼠心肌CollagenⅠ免疫熒光結(jié)果（×400）Fig.2 Immunofluorescence staining of CollagenⅠin heart tissue of different groups（× 400）

圖3 各組大鼠心肌TGF?β免疫熒光結(jié)果（×400）Fig.3 Immunofluorescence staining of TGF?β in heart tissue of different groups（× 400）

血流動力學是2型心腎綜合征發(fā)病的始動因素［6］，慢性心衰導致的血流動力學紊亂在誘發(fā)慢性腎功能不全的同時，可激活神經(jīng)激素機制、促進腎素的釋放，誘發(fā)心肌纖維化，加重心室重構(gòu)，最終心腎共同衰竭。因此，抑制心肌纖維化、改善心肌收縮力，從而改善血流動力學狀態(tài)，是控制心衰和慢性腎病發(fā)展的重要手段［7］。

本研究顯示，隨著去甲烏藥堿劑量增高，在心功能提高的同時，腎功能逐漸得到改善，體現(xiàn)出呈劑量依賴性的心腎保護作用。EF%顯著升高，Hw/W、LVw/W、LKw/W均明顯降低，血肌酐明顯下降、尿肌酐排出明顯增多、濾過率明顯改善，尿蛋白、血尿素氮、顯著降低。心肌纖維化面積逐漸減少，纖維化因子CollagenⅠ和TGF?β表達逐漸降低，說明去甲烏藥堿抑制心肌纖維化作用可能是通過抑制纖維化通路TGF?β/smads或者纖維化旁路ERK1/2實現(xiàn)，需進一步研究探尋其具體機制。

近年來有研究表明，硫酸吲哚酚（IS）可能與2型心腎綜合征大鼠心腎纖維化相關(guān)［8-9］。作為蛋白質(zhì)結(jié)合的尿毒癥毒素之一，IS無法通過透析除去［10］，在體內(nèi)蓄積易誘發(fā)心肌纖維化，還可激活免疫細胞誘發(fā)冠動脈斑塊形成［11］，增加心血管事件發(fā)生的風險。研究結(jié)果顯示模型大鼠血清IS水平顯著升高，心腎功能損傷效果明確。去甲烏藥堿低、中、高劑量組血清IS水平呈逐漸降低趨勢，說明去甲烏藥堿有潛在的促IS排泄的作用，可能與血流動力學改善、腎功能好轉(zhuǎn)有關(guān)，但具體機制仍需進一步研究。

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