微小RNA?758?3p在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響

王瑾 張梅君 李云峰 廖立凡湖北省第三人民醫(yī)院口腔科（武漢430030）；西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（西安70004）

舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，常伴有早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，惡性程度高［1］?；蛩降闹委熞殉蔀樯圜[狀細(xì)胞癌研究的重要方向［2］。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，可引起下游基因mRNA的降解或抑制其翻譯，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、衰老等生物學(xué)行為［3-4］。miR?758?3p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的miRNA，對(duì)miR?758?3p的研究報(bào)道較少。已有研究證實(shí)，miR?758?3p可在肝癌和宮頸癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用［5-6］。本研究擬通過(guò)轉(zhuǎn)染miR?758?3p至舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株，探討miR?758?3p在舌鱗狀細(xì)胞癌中的作用機(jī)制及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM?F12、高糖DMEM、DK?SFM和胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CAL27、HNl3、SCC15、TSCCA和人正?？谇火つぜ?xì)胞HOK購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。引物購(gòu)于南京金斯瑞公司。miR?758?3p 模擬物、miR?NC）、TRIM44野生型質(zhì)粒（TRIM44?WT）和 TRIM44突變型質(zhì)粒（TRIM44?MT）購(gòu)于上海漢恒生物科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pro?mega公司。一抗均購(gòu)于美國(guó)BD公司。MTT試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 CAL27細(xì)胞培養(yǎng)在10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，HNl3和TSCCA細(xì)胞培養(yǎng)在10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，SCC15細(xì)胞培養(yǎng)在10%FBS的DMEM?F12培養(yǎng)基，HOK細(xì)胞培養(yǎng)在DK?SFM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的TSCCA細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，將miR?NC（對(duì)照組）或miR?758?3p（實(shí)驗(yàn)組）分別轉(zhuǎn)染至TSCCA細(xì)胞。

1.2.2 RNA提取和qPCR檢測(cè) 收集細(xì)胞，使用Trizol?氯仿-異丙醇法提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，PCR擴(kuò)增檢測(cè)得到循環(huán)閾值（Ct），采用 2?ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。以U6為內(nèi)參檢測(cè)miR?758?3p的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)TRIM44 mRNA的表達(dá)。

1.2.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證 microRNA.org軟件預(yù)測(cè)顯示，miR?758?3p與TRIM44之間存在較好的堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系，見(jiàn)圖1。將對(duì)數(shù)期的TSCCA細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度為60%～70%，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，嚴(yán)格根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.2.4 Western blot檢測(cè)TRIM44蛋白的相對(duì)表達(dá)量 收集各組細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白，通過(guò)SDS?PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，封閉后加入一抗4°C下孵育過(guò)夜，室溫下二抗孵育1 h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）發(fā)光液顯影。

表1 qPCR引物序列Tab.1 qPCR primer sequences

圖1 miR?758?3p與TRIM44 3′?UTR互補(bǔ)配對(duì)的序列Fig.1 Sequence of miR?758?3p complementary binding to TRIM44 3′?UTR

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 收集各組細(xì)胞，預(yù)冷的70%乙醇溶液重懸固定過(guò)夜，100 mg/L RNase A重懸，在37°C水浴孵育15 min，加入含50 mg/L碘化丙啶溶液的PBS緩沖液500 μL，4℃避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的細(xì)胞周期分布。

1.2.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 收集各組細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。于1、2、3、4和5 d時(shí)分別取各時(shí)段的細(xì)胞，每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔光密度OD值。

1.2.7 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集各組細(xì)胞，以2×104/孔接種于Transwell上室，下室加入600 μL含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。棉簽擦去上室內(nèi)未穿過(guò)孔膜的細(xì)胞，使用1 mL 4%多聚甲醛固定10 min，使用1 mL 0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較分析，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中miR?758?3p的表達(dá) qPCR結(jié)果顯示，人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CAL27、HNl3、SCC15、TSCCA和人正常口腔黏膜細(xì)胞HOK細(xì)胞中miR?758?3p的相對(duì)表達(dá)量分別為：0.51±0.06、0.64±0.11、0.57±0.09、0.28±0.13和1.00 ± 0.09，miR?758?3p在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于其在正?？谇火つぜ?xì)胞中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TSCCA細(xì)胞中miR?758?3p表達(dá)水平最低，故以TSCCA細(xì)胞為后續(xù)研究模型。

2.2 qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR?758?3p和TRIM44 mRNA的表達(dá) qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組TSCCA細(xì)胞中miR?758?3p的相對(duì)表達(dá)量分別為63.89±11.24和1.09±0.47（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組TSCCA細(xì)胞中TRIM44 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 miR?758?3p與TRIM44的靶向關(guān)系 構(gòu)建野生型和突變型的TRIM44真核表達(dá)載體。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示共轉(zhuǎn)染miR?758?3p+TRIM44?WT的TSCCA細(xì)胞熒光活性顯著下降（P＜ 0.01，圖2）。

圖2 各組TSCCA細(xì)胞中熒光素酶活性的比較Fig.2 Comparison of luciferase activity in TSCCA cells of two groups

2.4 過(guò)表達(dá)miR?758?3p下調(diào)TSCCA細(xì)胞中TRIM44蛋白表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組TSCCA細(xì)胞中TRIM44蛋白的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，mTOR磷酸化水平降低，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4和Cyclin D1蛋白表達(dá)降低，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的上皮表型β?catenin蛋白表達(dá)升高，間質(zhì)表型Vimentin蛋白表達(dá)降低（圖3）。

2.5 過(guò)表達(dá)miR?758?3p抑制TSCCA細(xì)胞周期進(jìn)展 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR?758?3p后，TSCCA細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞比例明顯升高（P＜ 0.01），表明miR?758?3p可抑制TSCCA細(xì)胞周期進(jìn)展。

2.6 過(guò)表達(dá)miR?758?3p抑制TSCCA細(xì)胞的增殖活性 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR?758?3p后，TSCCA細(xì)胞由第4天開(kāi)始，增殖活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖4）。

圖3 miR?758?3p對(duì)TSCCA細(xì)胞中TRIM44蛋白及下游蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of miR?758?3p on the expression of TRIM44 protein and downstream proteins in TSCCA Cells

Fig.4 The proliferative activity of TSCCA cells in two groups was detected by MTT圖4 MTT檢測(cè)兩組TSCCA細(xì)胞的增殖活性

2.7 過(guò)表達(dá)miR?758?3p對(duì)TSCCA細(xì)胞的遷移能力的影響 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組TSCCA細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)［（34.11±7.33）個(gè)］明顯低于對(duì)照組組［（71.56±14.26）個(gè)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），表明過(guò)表達(dá)miR?758?3p可抑制TSCCA細(xì)胞的遷移能力。

3 討論

基因靶向治療是近年來(lái)舌鱗狀細(xì)胞癌防治研究的熱點(diǎn)［7］。miRNA通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)相關(guān)下游的基因表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，具有癌基因和抑癌基因的作用［8-10］。有研究［5］顯示，miR?758?3p在肝癌組織及其細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)均降低，轉(zhuǎn)染miR?758?3p后可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR?758?3p在其他腫瘤如舌鱗狀細(xì)胞癌的功能及作用機(jī)制尚不清楚。

本研究中，qPCR結(jié)果顯示miR?758?3p在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯下調(diào)，表明miR?758?3p可能參與舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。通過(guò)microRNA.org軟件預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR?758?3p的下游基因是三結(jié)構(gòu)域蛋白44（TRIM44）。TRIM44是三結(jié)構(gòu)域蛋白（TRIM）家族成員之一，是細(xì)胞生物學(xué)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的形成和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［11］。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等多種細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［12］。TRIM44能通過(guò)mTOR信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和增殖［13］。Western blot結(jié)果顯示，miR?758?3p 下調(diào)TRIM44蛋白表達(dá)后，TSCCA細(xì)胞中mTOR的磷酸化水平明顯降低，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK6和Cyclin D1蛋白表達(dá)下降，上皮細(xì)胞表型β?catenin蛋白表達(dá)升高，間質(zhì)細(xì)胞表型Vimentin蛋白表達(dá)下降。過(guò)表達(dá)miR?758?3p可明顯抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株細(xì)胞周期的進(jìn)展，降低細(xì)胞增殖能力，抑制細(xì)胞的遷移能力。

本研究結(jié)果顯示，miR?758?3p在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中低水平表達(dá)，可通過(guò)抑制TRIM44基因的表達(dá)，干擾mTOR信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和遷移。miR?758?3p可能為舌鱗狀細(xì)胞癌的分子治療提供了新的靶點(diǎn)。

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