手霉素通過上調P53誘導22Rv1前列腺癌細胞凋亡

李勁高 陳景 佘妙容中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院腎內科（廣州500）；廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院 醫(yī)學研究部，血液科（廣州50080）

在美國，前列腺癌（prostate cancer，PC）是男性最常見的惡性腫瘤［1-2］，中國男性PC的發(fā)病率和病死率低［3-4］，但發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，在70歲以上的中國男性泌尿生殖系腫瘤排第一位，前列腺癌已成為嚴重影響我國男性健康的惡性腫瘤，目前的治療手段主要包括手術、放療、激素治療、化療和聯(lián)合治療。然而，PC細胞對化療和放療治療均不敏感，因此，迫切需要新的有效治療方法。靶向異常信號轉導系統(tǒng)誘導細胞凋亡是殺傷惡性腫瘤細胞的重要方法之一。Ras信號通路是腫瘤細胞重要的生存通路，很多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞存在Ras原癌基因突變，譬如前列腺癌細胞［5］。法尼?；D移酶抑制劑（Farnesyltransferase inhibitors，F(xiàn)TIs）能通過選擇性抑制法尼基蛋白轉移酶抑制Ras信號通路，手霉素，則是在鏈絲菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的FTIs。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)手霉素能誘導白血病和甲狀腺癌細胞發(fā)生凋亡［6-9］，還能促使腫瘤細胞發(fā)生DNA損傷，然而它在抗PC細胞的作用及機制仍不清楚。本研究以人前列腺癌22Rv1細胞為研究對象，旨在探討手霉素對前列腺癌細胞的殺傷作用及其機制，以期為前列腺癌的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細胞系和試劑 22Rv1細胞系購自美國Type Culture Collection，在10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中生長。本研究實驗均取對數(shù)生長期的22Rv1細胞。手霉素，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）和二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）購自Sigma（St Louis，MO）公司。RPMI1640組織培養(yǎng)液購自Gibco有限公司。胎牛血清購自HyClone（Logan，UT，USA）公司，抗?caspase?3抗體和抗?P53抗體、抗H2AX抗體購自Cell Signaling Technol?ogy（Danvers，MA，USA）公司，Annexin V結合緩沖液和 annexin V 購自 BD Biosciences（San Jose，CA，USA）公司。用組織培養(yǎng)級的DMSO溶解手霉素配制成儲存液，放-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，實驗時將手霉素稀釋成所需的濃度，并保證DMSO在細胞培養(yǎng)液中的濃度不超過0.001。

1.2 MTT測定法檢測細胞的活性 將對數(shù)生長期的22Rv1細胞離心收集，以5 000個細胞/孔為起始密度種植到96孔板過夜，加入不同濃度的手霉素（每個濃度至少設定3個復孔）處理48 h后，每孔加入MTT試劑（3 mg/mL）20 μL，在培養(yǎng)箱孵育4 h，之后以1 500 r/min離心15 min，棄去上清，每孔加入200 μL DMSO溶解細胞團，最后在酶標儀上測定OD值，并做好記錄。

1.3 Annexin v/PI流式細胞術測定 將22Rv1細胞接種到小培養(yǎng)皿中過夜，加入手霉素處理24 h后離心收集細胞團。染色時，細胞用預冷的PBS溶液洗2次，重懸在1×結合緩沖液里，100 μL溶液移到5 mL 培養(yǎng)管，加入 5 μL Annexin V?FITC和5 μL PI，輕輕搖動細胞室溫避光培養(yǎng) 15 min，加入400 μL結合緩沖液在流式細胞儀上進行分析。做3次獨立實驗。

1.4 細胞裂解 離心收集經(jīng)手霉素處理16 h后的細胞放冰上，冷PBS洗滌細胞后加入裂解液充分裂解，4℃、20 630×g離心取上清液即為實驗所需蛋白液，最后測蛋白濃度。

SDS?PAGE和免疫印跡 將提取的蛋白上樣，SDS電泳，隨后冰水中電轉移到PVF膜，阻斷非特異蛋白，一抗孵育過夜后洗膜3次，二抗孵育60 min，洗膜3次，加入ECL溶液孵育1 min，用Kodak X?AR膠卷記錄產生的熒光圖像。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，以±s表示數(shù)據(jù)，各實驗組間的比較均采用單因素方差分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 手霉素減少22Rv1前列腺癌細胞活性 不同濃度的手霉素（0～32 μmol/L）處理22Rv1細胞48 h，MTT方法檢測細胞活性。如圖1所示，隨著手霉素濃度的增加，22Rv1細胞的活性逐漸減少，呈濃度依賴性。

圖1 手霉素減少22Rv1前列腺癌細胞的活性Fig.1 Cytotoxic effect of manumycin against 22Rv1 prostate cancer cell line

2.2 手霉素誘導22Rv1前列腺癌細胞凋亡 如圖2所示，和DMSO處理的對照組相比，手霉素處理24 h后，早期凋亡率（%）（31.32±1.23vs.0.91±0.01）和晚期凋亡細胞率（%）（27.23±0.94vs.0.29±0.03）均明顯增加（P＜0.05）。

圖2 手霉素誘導22Rv1前列腺癌細胞凋亡Fig.2 Manumycin induced apoptosis in 22Rv1 prostate cancer cell line

2.3 手霉素誘導22Rv1前列腺癌細胞Caspase3激活 培養(yǎng)的細胞分為2個治療組：DMSO對照組和32 μmol/L手霉素組，處理16 h。結果發(fā)現(xiàn)手霉素引起22Rv1前列腺癌細胞Caspase?3激活，其中包括pro?Caspase?3的減少和裂解激活Caspase?3的出現(xiàn)。見圖3。

2.4 手霉素誘導22Rv1前列腺癌細胞H2A.X磷酸化 如圖4所示，磷酸化H2AX的表達水平在用手霉素處理16 h后比對照組明顯增加，提示手霉素可以誘導DNA損傷。為進一步明確H2A.X磷酸化和凋亡的上下游關系，應用Caspase?9和全Caspase抑制劑對H2AX的影響，結果提示Caspase?9和全Caspase抑制劑可部分抑制H2AX的磷酸化，提示Caspase?9特異和全capspase抑制劑阻斷DNA損害，DNA損傷需要Caspase?9和全Caspase的激活，但沒有發(fā)生完全的凋亡。手霉素上調22Rv1前列腺癌細胞P53的表達如圖5所示，和DMSO對照組相比，手霉素上調P53的表達。

圖3 手霉素誘導22Rv1前列腺癌細胞Caspase?3激活Fig.3 Manumycin induced activation of caspase?3 in 22Rv1 prostate cancer cell line

圖4 手霉素介導22Rv1細胞DNA損害Fig.4 Manumycin?mediated DNA damage in22Rv1 cells

圖5 手霉素上調22Rv1前列腺癌細胞P53的表達Fig.5 Manumycin up?regulated the expression of P53 in 22Rv1 cells

3 討論

這個研究提示手霉素通過上調22Rv1細胞的P53表達、增加H2AX磷酸化、誘導capsase3激活有效誘導前列腺癌22Rv1細胞凋亡。

FTIs用于治療實體瘤和惡性血液病，我們既往的研究發(fā)現(xiàn)手霉素誘導甲狀腺癌和白血病細胞凋亡。我們的結果提示手霉素通過增加22Rv1細胞的早期和晚期凋亡，從而減低22Rv1前列腺癌細胞活性，這些發(fā)現(xiàn)證實和擴展了FTIs誘導慢性髓性白血病細胞、乳腺癌細胞和黑色素瘤細胞凋亡的結果［10-11］。很多癌癥發(fā)現(xiàn)有凋亡途徑的異常，而凋亡的缺失是前列腺癌的致癌原因之一，因此，很多常規(guī)的治療著重于誘導凋亡。

凋亡通過抗凋亡和促凋亡效應分子調節(jié)，通過內源性和外源性信號通路介導。這些信號通路影響線粒體的膜電位，誘導Caspase?9激活，隨后激活效應分子Caspase?3，激活Caspase?3導致細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)手霉素通過增加Caspase?3激活誘導22Rv1細胞凋亡。

化療藥物可通過誘導凋亡、DNA損害和細胞周期阻滯抑制腫瘤細胞生長。凋亡研究發(fā)現(xiàn)很多原癌和抑癌基因與調節(jié)凋亡有關。腫瘤抑制基因P53是一種被深入研究的決定性基因之一，它可以調節(jié)DNA的復制，激活依賴于P53的凋亡途徑，通過DNA損害從而促進細胞周期阻滯和凋亡的轉錄因子，抑制腫瘤細胞的增殖，具有良好的抗腫瘤作用［12-13］。既往的研究發(fā)現(xiàn)凋亡誘導劑可造成腫瘤細胞依賴和非依賴于P53的凋亡。在人類至少50%的腫瘤P53可突變或失活而失去野生型的功能而導致腫瘤的發(fā)展［14］。在包括DNA損害在內的各種壓力下P53通過轉錄因子激活［15］。對這種壓力的反應，P53結合特異的DNA序列，最終驅動涉及細胞周期阻滯和凋亡的轉錄基因，激活P53殺傷腫瘤細胞［14-16］。我們的結果發(fā)現(xiàn)手霉素可以上調P53的表達，誘導蛋白質翻譯后P53修飾而增加細胞內P53水平，誘導腫瘤細胞內P53表達從而誘導依賴于P53的凋亡，是一種有前景的治療方案。

DNA損害常常被認為是細胞壓力的原因，如藥物或放射治療結合到DNA直接誘導細胞壓力。然而既往的研究提示DNA損害可以是細胞壓力的結果。這雙重的作用提示DNA損害在應激系統(tǒng)起重要的作用，通過正反饋發(fā)展和放大。本研究結果提示手霉素可以誘導DNA損害，但Caspase?9和全Caspase抑制劑可部分抑制H2A.X的磷酸化，提示Caspase?9特異性和全Caspase抑制劑阻斷DNA損害，DNA損傷需要Caspase?9和全Caspase的激活。

終上所述，筆者發(fā)現(xiàn)手霉素可以通過上調P53的表達，增加H2AX磷酸化而誘導細胞凋亡。本研究闡明了手霉素有效治療前列腺癌的機制，為治療前列腺癌提供潛在的治療方法。

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