調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與吲哚胺2，3-雙加氧酶在乙肝感染者外周血中表達(dá)的相關(guān)性

楊峻 王前 石青峰 苗海霞 呂仁華南方醫(yī)科大學(xué)（廣州5055）；桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科（廣西桂林5400）；桂林出入境檢驗檢疫局保健中心（廣西桂林54004）

全球約有4億人曾經(jīng)感染過乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），慢性攜帶者超過3.7億［1］，其中我國約1.2億［2］。感染者對HBV抗原的免疫應(yīng)答不足是HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)和慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要發(fā)病機制［3］。吲哚胺-2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3?dioxygen?ase，IDO）作為色氨酸沿犬尿氨酸代謝途徑的限速酶，在病毒感染及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4］，IDO可導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境中色氨酸的耗竭，從而使細(xì)胞處于一種“色氨酸饑餓”狀態(tài)，對于迅速分裂期的細(xì)胞或病原微生物尤為敏感。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一群特殊的CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制和免疫無能的特性，可控制外周自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致對腫瘤及感染性疾病的免疫耐受［5］。有研究表明［6］，IDO不但“剝奪”病原微生物的色氨酸，同時也“剝奪”T細(xì)胞的色氨酸，導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡，但IDO與Treg細(xì)胞間的調(diào)控關(guān)系尚未明晰。近年來，IDO與Treg細(xì)胞在HBV慢性感染中的作用受到廣泛關(guān)注，但具體機制尚未明了。本研究旨在通過分析乙肝患者外周血中的IDO表達(dá)情況、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）以及CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞各指標(biāo)間的相關(guān)性，初步探討外周血中IDO表達(dá)上調(diào)與Treg細(xì)胞之間的關(guān)系，為CHB的發(fā)病機制及臨床研究提供一些實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入2012年9月至2014年1月我院收治的不同感染狀態(tài)的HBV感染者142例，男 75例，女67例；年齡 18～66歲，平均（41.7±10.2）歲。將其分為4組：CHB組44例，急性乙型肝炎組（acute hepatitis B，AHB）31例，肝硬化組（HBV?related liver cirrhosis，LC）29例和肝癌組（HBV?related hepatocellular carcinoma，HCC）28例。對照組28例，均為未患有肝炎的健康人群，男16例，女12例；年齡19～49 歲，平均（39.5±7.9）歲。各組研究對象的基線資料具有可比性，見表1。

表1 各組研究對象年齡和性別的比較Tab.1 Comparison of age and sex between groups

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) AHB及CHB組診斷標(biāo)準(zhǔn)均參考2015年《慢性乙型肝炎防治指南》［2］，AHB 為6個月以內(nèi)出現(xiàn)HBsAg和（或）HBV DNA陽性，伴有ALT＞38 IU/L及肝功能異常；CHB患者均為HBsAg和（或）HBV DNA陽性6個月以上，伴有ALT＞38 IU/L及肝功能異常。HCC患者均符合2017年《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》［7］診斷標(biāo)準(zhǔn)，HBsAg陽性且AFP≥400 ng/mL；LC組均符合2014年《乙型肝炎病毒相關(guān)肝硬化的臨床診斷、評估和抗病毒治療的管理》［8］診斷標(biāo)準(zhǔn)，HBsAg陽性且病理學(xué)確證肝硬化結(jié)節(jié)已完全形成。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）藥物性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病及其他類型病毒性肝炎者。（2）合并嚴(yán)重心、肝、腎慢性疾病患者；（3）排除妊娠及生殖腺胚胎源性腫瘤；（4）病歷資料不完整者；（5）近期合并其他感染的患者；（6）不能完成隨訪的患者。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集與檢測 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。所有患者均在清晨空腹采集靜脈血，用EDTA抗凝試管采集2管，每管5 mL，用肝素鋰抗凝試管采集1管，3 mL，立即送檢。

1.4.2 流式細(xì)胞檢測 （1）流式細(xì)胞分析儀型號為EPICS XL，美國貝克曼公司生產(chǎn)。溶血素、鞘液及鼠抗人CD4-CP/CD25-PE/CD127-FITC均購自美國貝克曼公司。（2）標(biāo)本制備：在裝有100 μL抗凝全血的試管中分別加入5 μL鼠抗人CD4-CP/CD25-PE/CD127-FITC單抗混勻，室溫下避光孵育15 min，加入溶血素1 mL混勻，避光放置12 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，再次加入PBS 2 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS 300 μL重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.3 IDO mRNA檢測

1.4.3.1 分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC） 用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll?Paque）進行密度梯度離心（于22℃3 300 r/min離心20 min）獲取PBMC。

1.4.3.2 主要試劑及引物 Trizol使用Invitrogen公司產(chǎn)品；PCR試劑盒使用Toyobo公司生產(chǎn)的RNA?directed SYBR Green RT?PCR Master Mix。引物設(shè)計及合成：引物均遵循引物設(shè)計原則進行設(shè)計，引物序列由Invitrogen公司合成。

1.4.3.3 IDO mRNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 PBMC IDO mRNA提取按照試劑盒（QIAGEN）說明進行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明進行操作。

1.4.3.4 熒光實時定量PCR檢測 熒光實時定量PCR檢測（RT?PCR）所用染料為DYBR Green。反應(yīng)條件：預(yù)變性93℃ 2 min，擴增93℃10 s，58℃30 s，40個循環(huán)，擴增循環(huán)結(jié)束后進行熔點曲線檢測：45～90℃，升溫速度0.2℃/s，連續(xù)檢測熒光；最后降溫至40℃；擴增結(jié)束后，利用配套軟件進行檢測和分析。

1.4.4 ALT活性檢測 ALT檢測試劑盒購自羅氏診斷有限公司，使用羅氏Cobas C702全自動生化分析儀按操作說明進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較使用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IDO mRNA IDO mRNA表達(dá)總體組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），見表2。IDO mRNA表達(dá)從高到低依次為HCC組、AHB組、CHB組、LC組和對照組。HCC組明顯高于其他4組（P＜0.01），其余各組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 外周血IDO mRNA、轉(zhuǎn)氨酶及Treg細(xì)胞計數(shù)結(jié)果比較Tab.2 Comparison between IDO mRNA，ALT and Treg in the blood samples ±s

表2 外周血IDO mRNA、轉(zhuǎn)氨酶及Treg細(xì)胞計數(shù)結(jié)果比較Tab.2 Comparison between IDO mRNA，ALT and Treg in the blood samples ±s

注：與LC組比較，#P ＜0.05；與HCC組比較，△P ＜0.05，與AHB組比較，▲P＜0.01；其他數(shù)據(jù)各組間兩兩比較，均P＜0.05

組別對照組CHB組AHB組LC組HCC組F值P值例數(shù)28 44 41 29 28 IDO mRNA（× 103copies/mL）0.67± 0.41△1.11± 0.62△1.22± 0.77△1.05± 0.47△2.63±0.84#▲37.793 0.000 ALT（U/L）17.96 ± 10.87△▲71.50 ± 41.39△▲123.39 ± 104.28△#51.48±13.19▲61.25±24.94▲15.567 0.000 Treg細(xì)胞（%）2.87 ± 1.19△▲3.65±1.30△4.37±1.46#△4.04±1.20△9.62±3.67▲8.226 0.000

2.2 Treg細(xì)胞檢測 總體組間比較，除CHB組外，各組Treg細(xì)胞與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其中HCC組明顯高于其他3組（F=10.764，P=0.002），Treg計數(shù)從高到低依次為HCC組、AHB組、LC組、CHB組和對照組。見表2。

2.3 ALT檢測結(jié)果 總體組間比較，除LC組外，各組ALT活性與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

2.4 Treg細(xì)胞、ALT、IDO mRNA相關(guān)性分析ALT活性與IDO mRNA表達(dá)相關(guān)性較低（r=0.196，P=0.026），Treg細(xì)胞與IDO mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.912，P=0.000）。見圖1。

3 討論

圖1 HBV感染患者外周血IDO mRNA、ALT、Treg表達(dá)相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between IDO mRNA，ALT and Treg in the blood of hepatitis B patients

HBV在病毒感染發(fā)生、發(fā)展過程中會演化出種種逃避免疫監(jiān)視的方式，宿主自身免疫系統(tǒng)不能有效清除病毒而發(fā)生免疫耐受，HBV感染誘導(dǎo)自身免疫耐受的機制目前尚未完全闡明。近年研究表明［9-10］，IDO的高表達(dá)，可導(dǎo)致腫瘤或體液局部微環(huán)境中色氨酸耗竭，同時伴有Treg細(xì)胞水平增高的現(xiàn)象，兩者相互作用與影響，可能導(dǎo)致病毒或腫瘤細(xì)胞逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。IDO和Treg細(xì)胞的關(guān)系為研究HBV免疫耐受導(dǎo)致感染的機制提供了一個新的方向。

人體感染HBV后，體內(nèi)抵御病毒的免疫反應(yīng)主要為細(xì)胞免疫，如T淋巴細(xì)胞通過有效的溶細(xì)胞或非溶細(xì)胞機制清除病毒，感染即可得到控制；反之，病毒將長期存在［11］。HBV感染慢性化的原因主要是感染者對HBV抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答不足，表現(xiàn)為免疫耐受。HBV可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究中，各實驗組IDO mRNA表達(dá)與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HCC組IDO mRNA表達(dá)增高說明，IDO通過分解代謝色氨酸抑制免疫細(xì)胞功能，是機體免疫耐受功能的重要調(diào)節(jié)因子［12］。IDO表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致機體參加免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞不足，致機體免疫功能低下，HBV不能有效清除。而AHB組和CHB組感染患者IDO mRNA表達(dá)均較對照組增強，說明HBV感染早期病毒誘導(dǎo)上調(diào)IDO，抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)不足，使病毒持續(xù)存在。在CHB組中的IDO表達(dá)持續(xù)升高導(dǎo)致免疫抑制和減少T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，為病毒播散及持續(xù)感染創(chuàng)造了條件，使感染慢性化形成惡性循環(huán)［13］。而LC組中IDO mRNA表達(dá)與對照組比較差異無顯著性，表明在肝硬化發(fā)生時機體免疫抑制狀態(tài)與正常組并無差距。

不少報道［14］指出IDO可以通過介導(dǎo)對色氨酸的降解及其代謝產(chǎn)物的作用來抑制T細(xì)胞的作用，從而幫助腫瘤逃避免疫監(jiān)視。由于T細(xì)胞對色氨酸耗竭尤為敏感，在色氨酸濃度較低時，T細(xì)胞的增殖被抑制，細(xì)胞分化靜止在G1期。這種靜息的T細(xì)胞更容易凋亡，從而造成T細(xì)胞的缺乏。而色氨酸的分解代謝產(chǎn)物對T細(xì)胞的增殖也有抑制作用［15］，本研究在肝癌組與對照組中，均進行了Treg細(xì)胞流式檢測，結(jié)果顯示肝癌組中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例為（9.62±3.67）%，高于其余各組，提示IDO的表達(dá)上調(diào)對Treg細(xì)胞沒有明顯的抑制作用。Treg計數(shù)從高到低依次為HCC組、AHB組、LC組、CHB組和對照組，且CHB組Treg細(xì)胞計數(shù)與對照組差異無顯著性，說明隨著HBV感染加重，導(dǎo)致肝臟功能惡化后Treg細(xì)胞的增加可能預(yù)示著預(yù)后不良。對Treg細(xì)胞的分析還表明，AHB組Treg細(xì)胞較對照組明顯升高，而CHB組與對照組相比差異無顯著性，說明在HBV急性感染期細(xì)胞免疫抑制增強，利于病毒感染發(fā)展，說明在乙肝患者病情進展中，隨著細(xì)胞免疫的增強，抑制細(xì)胞免疫的作用亦加強，以維持機體免疫平衡［16］。

ALT與HBV感染狀態(tài)下的肝功能損傷相關(guān)［17］，對ALT的活性研究表明，AHB組ALT活性最高，與其他各組相比較差異有顯著性，LC組ALT活性與對照組相比差異并無顯著性。本研究中各檢測項目間相關(guān)性分析顯示，在各實驗組中，IDO mRNA表達(dá)與ALT無明顯相關(guān)性（r=0.196，P=0.026），說明免疫抑制與肝細(xì)胞損傷間并無明顯相關(guān)。而對各實驗組IDO mRNA、Treg表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果為r=0.912，P=0.000，表明患者外周血中IDO表達(dá)與Treg細(xì)胞數(shù)量間存在正相關(guān)性，即IDO高表達(dá)伴隨著外周血Treg細(xì)胞比例增高，IDO和Treg細(xì)胞間可能存在著一個正反饋的調(diào)控環(huán)路，共同介導(dǎo)HBV的免疫耐受。而據(jù)曾道炳等［10］研究報道，IDO mRNA表達(dá)與CD4+T淋巴細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。由于本研究的局限，IDO與Treg細(xì)胞間的具體調(diào)控機制尚不明確，有待進一步研究。

總之，IDO與Treg細(xì)胞的相互作用可能是HBV感染慢性化及免疫耐受的另一原因，對其深入研究可為慢性HBV感染的治療提供一個全新思路。通過免疫學(xué)手段下調(diào)慢性HBV感染者的IDO與Treg水平，使特異性T淋巴細(xì)胞升高，可望重建患者的主動免疫，從而達(dá)到臨床治愈。

［1］ SONG J E，KIM D Y.Diagnosis of hepatitis B［J］.Ann Transl Med，2016，4（18）：338.

［2］ 王貴強，王福生，成軍，等.慢性乙型肝炎防治指南［J］.臨床肝膽病雜志，2015，31（12）：1941?1960.

［3］ AKBAR S M，AL?MAHTAB M，KHAN M S，et al.Immune therapy for hepatitis B［J］.Ann Transl Med，2016，4（18）：335.

［4］ MUNN D H，MELLOR A L.IDO in the tumor microenviron?ment：inflammation，counter?regulation，and tolerance［J］.Trends Immunol，2016，37（3）：193?207.

［5］ CHAUDHARY B，ELKORD E.Regulatory T Cells in the tumor microenvironment and cancer progression：role and therapeutic targeting［J］.Vaccines（Basel），2016，4（3）：E28.

［6］ JUNG M K，SHIN E C.Regulatory T cells in hepatitis B and C virus infections［J］.Immune Netw，2016，16（6）：330?336.

［7］ 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）［J］.臨床肝膽病雜志 2017，33（8）：1419?1431.

［8］ 科技部十二五重大專項聯(lián)合課題組專家.乙型肝炎病毒相關(guān)肝硬化的臨床診斷、評估和抗病毒治療的管理［J］.臨床肝膽病雜志，2014，30（2）：99?108.

［9］ CHENG J T，DENG Y N，YI H M，et al.Hepatic carcinoma?associated fibroblasts induce IDO?producing regulatory dendrit?ic cells through IL?6?mediated STAT3 activation［J］.Oncogene?sis，2016，22（5）：e198.

［10］ SCHAFER C C，WANG Y，HOUGH K P.Indoleamine 2，3?di?oxygenase regulates anti?tumor immunity in lung cancer by met?abolic reprogramming of immune cells in the tumor microenvi?ronment［J］.Oncotarget，2016，7（46）：75407?75424.

［11］ ZOU Z Q，WANG L，WANG K，et al.Innate immune targets of hepatitis B virus infection［J］.World J Hepatol，2016，8（17）：716?725.

［12］ 王敏，謝婷，謝震，等.吲哚胺2，3?雙加氧酶在皮膚惡性黑色素瘤中的表達(dá)及作用［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（19）：3205?3208.

［13］ ZIMMERMANN J A，HETTIARATCHI M H，MCDEVITT T C.Enhanced immunosuppression of T cells by sustained presenta?tion of bioactive interferon?γ within three?dimensional mesen?chymal stem cell constructs［J］.Stem Cells Transl Med，2017，6（1）：223?237.

［14］ CHENG J T，DENG Y N，YI H M，et al.Hepatic carcinoma?associated fibroblasts induce IDO?producing regulatory dendrit?ic cells through IL?6?mediated STAT3 activation［J］.Oncogene?sis，2016，22（5）：198.

［15］ ALDAJANI W A，SALAZAR F，SEWELL H F，et al.Expres?sion and regulation of immune?modulatory enzyme indoleamine 2，3?dioxygenase（IDO）by human airway epithelial cells and its effect on T cell？activation［J］.Oncotarget，2016，7（36）：57606?57617.

［16］ 樊海燕，劉曉.外周血T細(xì)胞亞群及Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值在乙肝病毒感染者診斷中的價值［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2016，45（10）：1387?1389.

［17］ MENG Z，ZHANG Y，WEI Z，et al.High serum resistin asso?ciates with intrahepatic inflammation and necrosis：an index of disease severity for patients with chronic HBV infection［J］.BMC Gastroenterol，2017，17（1）：6.