梅毒螺旋體誘導巨噬細胞分泌的外泌體特征及其對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

許卜方 王千秋 張瑞麗 張津萍

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所 中國疾病預防控制中心性病控制中心性病防治室（許卜方、王千秋），性病科（張津萍）；南京醫(yī)科大學附屬無錫第二醫(yī)院皮膚科（張瑞麗）

近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為一種直徑30～150 nm的胞外囊泡［1］，參與機體的免疫應答、抗原提呈、細胞遷移分化、腫瘤侵襲等［2］。外泌體攜帶的mRNA、miRNA、蛋白不僅可以作為細胞間通訊的重要介質傳遞信號以調節(jié)細胞組織的功能［3-4］，還可以作為疾病的生物標記物輔助診斷［5-6］、治療［7］、預后評估［8］。雖然梅毒的致病機制在免疫學方面已取得一些進展，但是外泌體在梅毒中的研究未見相關報道，因此在本研究中，我們通過研究Tp誘導巨噬細胞分泌的外泌體特征及其對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖的影響，從分子學角度為梅毒的致病機制提供線索。

材料與方法

一、材料

1.細胞系和致病菌：人單核巨噬細胞（human acute monocytic leukemia cell line，THP-1）為本實驗室保存，HUVEC來自北京協(xié)和醫(yī)學院基礎所細胞庫。梅毒螺旋體（Tp）Nichol株為本實驗室保存。動物實驗在南京軍區(qū)疾病預防控制中心開展［許可證號SYXK（軍）2012-0048］睪丸發(fā)育成熟的健康成年（3月余，2.5～3 kg）新西蘭雄兔來源于江蘇省農業(yè)科學院六合動物科學基地實驗兔場（動物合格證號201615918），在接種前后不接觸任何抗生素，質量等級普通級，在18～20℃環(huán)境中飼養(yǎng)；所有兔在接種前進行非螺旋體試驗（VDRL或RPR），檢測均為陰性。

2.主要試劑及儀器：RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），CCK8試劑（日本同仁化學研究所），PKH67（美國Sigma公司），外泌體提取試劑盒（德國Qiagen公司，cat 76164），BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western印跡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），CD63、CD9、CD81一抗及二抗（美國CST公司），OLYMPUS IX81激光共聚焦顯微鏡，JEM1230透射電鏡（日本JEOL公司），qNano Gold粒徑測試儀（新西蘭Izon Science公司）。

二、方法

1.Tp的獲?。簩p標準菌株接種于新西蘭雄兔雙側睪丸，飼養(yǎng)2周后開始每2天抽取兔耳緣靜脈血1 ml進行RPR測定，待滴度上升至1∶64左右且睪丸硬、腫時，將兔予以安樂死，無菌摘取雙側睪丸，剪碎、萃取、離心、沉淀，獲得較純的Tp用于后續(xù)實驗。

2.巨噬細胞和HUVEC培養(yǎng)：THP-1細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，收集所有THP-1細胞懸液，取10 μl滴于細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，離心棄上清液，將THP-1細胞沉淀在RPMI 1640（含10%胎牛血清）中重懸，按1×106/孔接種于100 mm×20 mm細胞培養(yǎng)皿，加入50 μg/L丙二醇甲醚醋酸酯（PMA），37℃、5%CO2孵箱中孵育約24 h后細胞貼壁，呈多角形，即分化為巨噬細胞用于后續(xù)實驗［9-10］。在DMEM（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)HUVEC，處于對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

3.外泌體的提取：被PMA刺激分化的巨噬細胞在RPMI 1640（含10%胎牛血清）新鮮培養(yǎng)基中37℃、5%CO2繼續(xù)孵育24 h。用RPMI 1640重懸Tp，取10 μl于暗視野顯微鏡下觀察活力并計數(shù)，取1×107Tp按照10∶1（Tp與巨噬細胞）的感染數(shù)加入接種有巨噬細胞的100 mm×20 mm培養(yǎng)皿，刺激12 h［11］。更換培養(yǎng)基為含10%無外泌體的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。多次高速離心，棄沉淀，按照外泌體提取試劑盒手冊操作，加入外泌體洗脫液XE制成外泌體懸液作為實驗組外泌體（EXOTp）。自未加Tp刺激的巨噬細胞提取的外泌體懸液為對照組外泌體（EXO）。

4.外泌體鑒定：

（1）透射電鏡觀察：吸取外泌體懸液約50 μl于26 cm×19 cm×2 cm解剖盤上。取一有支持膜的銅網與解剖盤上的外泌體懸液接觸，靜置3～5 min，取出銅網，晾干。取3%磷鎢酸溶液約50 μl滴于蠟盤上，將銅網放置于3%磷鎢酸染液表面染色3～5 min，取出銅網，白熾燈下晾干，電鏡拍照。

（2）Western印跡檢測：BCA蛋白定量法測定外泌體蛋白含量。制膠（12%分離膠，5%濃縮膠），取15 μl樣品在80 V恒壓下電泳30 min，120 V恒壓電泳1 h。轉膜2 h。5%牛血清白蛋白封閉2 h，分別加入兔抗人CD63（1∶1 000稀釋）、CD9（1∶1 000稀釋）、CD81（1∶1 000稀釋）、β微管蛋白（1∶1 000稀釋）單克隆抗體4℃過夜孵育，TBST洗膜3次，室溫孵育羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋）2 h，TBST洗膜，配制顯影液，凝膠成像系統(tǒng)下顯影曝光［12］。

5.納米顆粒跟蹤分析技術（nanoparticle tracking analysis，NTA）定量測定外泌體［13］：將外泌體樣品1∶100稀釋后，取40 μl注入樣品槽中，加壓約700 Pa，讓樣品勻速通過納米孔。清洗樣品槽，在所有參數(shù)不變的情況下，再次注入已知濃度和直徑大小的標準樣品CPC100（平均直徑114 nm，濃度1× 1013顆粒/ml，稀釋倍數(shù)1∶1 000）作為參比條件，與待測樣品進行比對。運用軟件Izon Control Suite 3.3.2.2000對樣品和標準樣品數(shù)據(jù)進行校準。

6.外泌體體外活化HUVEC：將HUVEC（1×105個）懸液接種于激光共聚焦小皿中，于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，細胞貼壁生長。用熒光染料PKH67對外泌體避光染色5 min，取染色后的外泌體（1×106顆粒）與HUVEC（1×105個）共培養(yǎng)5 h，棄培養(yǎng)基上清液，用PBS沖洗2遍，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

7.HUVEC吞噬外泌體后的增殖水平：將100 μl（1×104個細胞/孔）HUVEC懸液接種于96孔板，于37℃、5%CO2孵箱孵育24 h，將細胞分為對照組、實驗組、外泌體洗脫液組，根據(jù)NTA測得的濃度分別加入10 μl EXO、EXOTp（4.5 × 108顆粒）、外泌體洗脫液（XE），孵育12、24、48、72 h，孵育完畢后加入CCK8 試劑10 μl，37 ℃避光孵育2 h。每組6個復孔，同時設置空白組（只加培養(yǎng)基，無細胞），酶標儀檢測波長450 nm處吸光度（A值）。

8.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。兩組外泌體粒徑大小符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用x±s表示，采用u檢驗；兩組外泌體濃度不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，采用配對樣本Wilcoxon符號秩檢驗進行統(tǒng)計學分析；各組HUVEC增殖水平數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用x±s表示，數(shù)據(jù)方差不齊采用兩獨立樣本Mann-Whitney檢驗進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、細胞和Tp形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下，由THP-1細胞分化來的巨噬細胞形態(tài)飽滿，貼壁生長，圓形或橢圓形，有偽足，胞質顆粒較多，細胞之間排列較為緊密。含血清DMEM培養(yǎng)的HUVEC呈扁平多角形，貼壁生長，鋪路石狀鑲嵌排列，細胞狀態(tài)可。Tp于暗視野顯微鏡下呈纖細、白色、有折光的螺旋狀微生物。雄兔睪丸接種Tp 2周左右，出現(xiàn)睪丸腫大等炎癥癥狀。

二、外泌體鑒定

透射電鏡下實驗組外泌體為直徑30～100 nm的微小囊泡，呈杯托樣結構。Western印跡顯示實驗組和對照組外泌體膜蛋白分子（CD63、CD9、CD81）的清晰條帶，三者相對分子質量分別為45 000、24 000、26 000。見圖1。圖1兩組外泌體3種膜蛋白分子中CD63表達量最高，CD81次之，CD9表達量最低。

三、NTA定量測定外泌體

NTA檢測兩組外泌體囊泡直徑50～150 nm，其中對照組外泌體顆粒直徑（104 ± 29）nm，濃度［M（P25，P75）］為2.93×1010（1.465×1010，4.395×1010）顆粒/ml；實驗組外泌體直徑（97±35）nm，濃度為3.8×1010（1.9 × 1010，5.7 × 1010）顆粒/ml。兩組外泌體顆粒直徑（u=1.90，P＞0.05）、濃度（z=-1.604，P=0.109）差異均無統(tǒng)計學意義。

四、HUVEC吞噬外泌體

PKH67染色后的兩組外泌體與HUVEC共培養(yǎng)5 h后，激光共聚焦顯微鏡下觀察，兩組HUVEC形態(tài)皆正常，呈鵝卵石樣排列。胞質內散在分布的綠色熒光顆粒即為染色后被HUVEC吞噬的外泌體，見圖2。

五、外泌體對HUVEC增殖水平的影響

見圖3。12 h時實驗組、對照組HUVEC增殖水平均高于外泌體洗脫液組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；24 h和48 h時對照組細胞增殖水平仍高于外泌體洗脫液組，在48 h達到峰值，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而實驗組與外泌體洗脫液組細胞在這兩個時間點增殖水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；72 h時實驗組、對照組與外泌體洗脫液組細胞增殖水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

討 論

圖1 巨噬細胞分泌的外泌體鑒定 1A：透射電鏡下觀察外泌體為直徑30～100 nm的微小囊泡，呈杯托樣結構；1B：Western印跡測定實驗組和對照組外泌體膜蛋白CD63、CD9、CD81的表達

圖2 PKH67染色后的外泌體與人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）共培養(yǎng)5 h后激光共聚焦顯微鏡下的內吞現(xiàn)象，綠色熒光顆粒為染色后的外泌體（×400）

圖3 CCK8法檢測人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）被外泌體刺激12、24、48、72 h后的增殖水平 EXO：未用梅毒螺旋體刺激的巨噬細胞分泌的外泌體；EXOTp：梅毒螺旋體刺激的巨噬細胞分泌的外泌體。HUVEC吞噬外泌體后12 h時，EXO、EXOTp兩組的HUVEC增殖水平均高于外泌體洗脫液組（均P＜0.05）；24 h和48 h時EXO組細胞增殖水平仍高于對照組（P＜0.01），而EXOTp與外泌體洗脫液組細胞增殖水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；72 h時實驗組、對照組與外泌體洗脫液組細胞增殖水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）

既往研究證實，Tp膜蛋白在梅毒致病過程中發(fā)揮重要作用。Tp借其表面的黏多糖酶吸附于細胞表面的受體，解離血管內皮細胞間的黏附連接，使組織壞死、炎癥發(fā)生、潰瘍形成、血管塌陷［14］。Tp對HUVEC的黏附性是上皮細胞的2倍，99%的HUVEC在Tp刺激后6 h仍有活性［15］，繼而趨化淋巴細胞和單核細胞黏附血管內皮細胞［11］，從而發(fā)生一系列血管炎癥反應致組織免疫病理損傷。

近年在炎癥性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，高血壓患者的巨噬細胞分泌的外泌體可以上調冠脈內皮細胞間黏附分子和纖溶酶原激活物抑制劑的表達，誘導冠脈內皮細胞發(fā)生炎癥反應［9］。Diaz等［10］運用蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)，THP-1來源的巨噬細胞感染結核分支桿菌后釋放的外泌體膜蛋白組成中有41種蛋白表達升高，其中63%的蛋白與細胞膜功能相關。

提取外泌體有許多方法，其中較好的是超高速離心法。本研究中，我們因受限于設備條件，退而選擇膜親和試劑盒提取外泌體，該試劑盒提取的外泌體存在純度問題，我們在實驗過程中盡量保證實驗組和對照組的條件一致以減少實驗誤差。在細胞增殖實驗中設置外泌體洗脫液組作用于HUVEC，是為了評估外泌體洗脫液本身對HUVEC增殖水平的影響。

已知Tp膜蛋白直接影響血管內皮細胞的黏附、炎癥、通透性，因此Tp作用于巨噬細胞后分泌的外泌體中是否具有Tp膜蛋白的相關遺傳信息非常值得研究。但目前限于Tp不能體外培養(yǎng)，無法提取Tp源性外泌體，因此我們從功能學層面探討Tp刺激巨噬細胞分泌的外泌體對血管內皮細胞的影響，為梅毒血管炎的分子機制研究提供一定的思路。本研究結果顯示，在體外實驗中，Tp誘導巨噬細胞分泌的外泌體在大小、濃度方面與正常巨噬細胞分泌的外泌體無異，但其作用于HUVEC后使得HUVEC的增殖水平下降，提示Tp刺激巨噬細胞后分泌的外泌體可能參與梅毒血管炎的致病過程，該結論還需體內實驗進一步驗證。

我們推測，Tp侵入宿主最初激活固有免疫應答，巨噬細胞被活化［14］，吞噬Tp后分泌的外泌體攜帶著Tp和巨噬細胞的遺傳信息，在體內輸送至血管，血管內皮細胞接收了外泌體攜帶的信號，調節(jié)自身的增殖水平，以削弱血管內皮細胞的再生修復能力，繼而為Tp致血管內皮細胞炎癥的發(fā)生及進展提供有利條件。研究證明，外泌體可以傳遞信號，改變信號通路，影響蛋白的組成，導致下游細胞的功能發(fā)生改變［9-10，16］。本研究顯示，HUVEC吞噬外泌體后12～48 h內，對照組HUVEC細胞增殖水平高于外泌體洗脫液組，在48 h達到峰值；實驗組HUVEC僅在外泌體作用12 h內增殖水平高于外泌體洗脫液組，隨著時間的推移，實驗組細胞增殖水平趨于正常。推測THP-1來源的巨噬細胞可能分泌攜有促進細胞增殖信號的外泌體作用于HUVEC使其增殖水平升高，而EXOTp可能攜有抑制/阻斷細胞增殖信號表達的相關遺傳信息，使其作用于HUVEC后僅在12 h內提高增殖水平，后恢復至正常水平。在72 h時3組間細胞增殖水平無明顯差異，說明外泌體在體外與HUVEC共培養(yǎng)72 h后不再影響HUVEC的增殖水平。這其中EXOTp影響HUVEC增殖的原因究竟是Tp本身的遺傳信息作用，還是巨噬細胞受Tp刺激后發(fā)生應答反應的相關信號作用，以及EXOTp對HUVEC增殖的影響與血管內皮細胞炎癥反應的發(fā)生是否相關，目前都尚不能明確，我們將在以后的研究中對此進行深入探討。