梅毒IgA快速檢測(cè)試劑診斷早期現(xiàn)癥梅毒的應(yīng)用性評(píng)估

韓燕 魏萬惠 尹躍平 David Anderson 王紅春 Mary L Garcia Huy Van 朱小宇 陳凱 陳祥生

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所 中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室（韓燕、魏萬惠、尹躍平、王紅春、朱小宇、陳凱），性病控制中心（陳祥生）；Burnet Institute（David Anderson、Mary L Garcia、Huy Van）

梅毒螺旋體在母體內(nèi)通過胎盤途徑感染胎兒，可引起早產(chǎn)、死產(chǎn)。加強(qiáng)孕婦的梅毒篩查，是減少梅毒垂直傳播的關(guān)鍵［1-3］。目前，梅毒的快速檢測(cè)試劑（POC，point-of-care）主要檢測(cè)梅毒的特異性抗體，不能夠有效區(qū)分現(xiàn)癥和既往梅毒感染，還需要快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）/甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）的輔助，限制了快速檢測(cè)方法的應(yīng)用。澳大利亞Burnet研究所研發(fā)了一種可快速鑒定患者是否為早期現(xiàn)癥梅毒的POC試劑（prototype IgA rapid test），前期Burnet研究所利用墨爾本參比實(shí)驗(yàn)室提供的100份血漿標(biāo)本檢測(cè)，顯示該試劑對(duì)現(xiàn)癥梅毒患者血漿（RPR滴度≥1∶8）檢測(cè)的靈敏度為91%，對(duì)既往梅毒患者血漿［梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）陰性，RPR陰性］的檢測(cè)特異性為80%。在本研究中，我們對(duì)該快速檢測(cè)試劑進(jìn)行了擴(kuò)大樣本量的實(shí)驗(yàn)室評(píng)估。

一、對(duì)象和方法

1.標(biāo)本：血清標(biāo)本來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所參比實(shí)驗(yàn)室。由于庫存標(biāo)本缺少患者主訴相關(guān)信息，我們主要依靠IgM酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（IgM-ELISA）、IgA-ELISA檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行未感染梅毒、既往感染梅毒和早期現(xiàn)癥梅毒的分組。本研究通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2016-臨快審-016）。

2.試劑：TPHA試劑、RPR試劑（英國Omega Diagnostics公司）；IgA-POC及IgA-ELISA試劑均由Burnet研究所提供，其制備IgA快速檢測(cè)試紙條中所使用的IgA抗原梅毒重組抗原購自美國Meridian Life Sciences公司；IgM-ELISA試劑（德國DRG公司）。

3.分組：標(biāo)本管理員根據(jù)標(biāo)本庫原先記錄的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)本抽樣，完成抽樣后，所有標(biāo)本經(jīng)TPHA和RPR檢測(cè)，并利用IgM-ELISA發(fā)現(xiàn)TPHA和RPR檢測(cè)漏檢的早期梅毒感染者。未感染組：IgM-ELISA檢測(cè)陰性或TPHA檢測(cè)陰性且RPR檢測(cè)陰性；既往感染組：TPHA檢測(cè)陽性、RPR檢測(cè)陰性且IgM-ELISA陰性；早期現(xiàn)癥組：IgM-ELISA檢測(cè)陽性或TPHA檢測(cè)陽性、RPR檢測(cè)陽性且滴度大于1∶8。為保證檢測(cè)人員對(duì)TPHA和RPR結(jié)果的盲法，在完成分組標(biāo)本的篩選后，對(duì)標(biāo)本二次編號(hào)，號(hào)碼按照隨機(jī)數(shù)生成器產(chǎn)生，然后按序排列。實(shí)驗(yàn)人員在后續(xù)過程中對(duì)所有標(biāo)本前期的檢測(cè)結(jié)果及分組信息未知。

4.IgA-POC檢測(cè)：凍存標(biāo)本室溫孵育至室溫后，10 000×g離心5 min，加入5 μl血清標(biāo)本至檢測(cè)板的A孔，然后加入1滴磷酸鹽緩沖液（PBS），10 min后再加入4滴PBS至B孔，20 min后觀察，質(zhì)控線出現(xiàn)粉紅色條帶時(shí)檢測(cè)有效，檢測(cè)線出現(xiàn)粉紅色條帶為陽性。

5.IgA-ELISA檢測(cè)：在96孔板中包被IgA抗原作為IgA-ELISA的檢測(cè)板。在酶標(biāo)板孔中加入100 μl標(biāo)本，37 ℃孵育1 h，洗板6次后加入100 μl抗人IgA辣根過氧化酶溶液繼續(xù)37℃孵育1 h，洗板6次后加入3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物100 μl，11 min后加入100 μl終止液，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（A值）。利用陰性質(zhì)控及空白質(zhì)控計(jì)算灰區(qū)值（cutoff），cutoff=（A陰性-A空白）× 0.9。每批實(shí)驗(yàn)單獨(dú)計(jì)算cutoff值，檢測(cè)的吸光度大于或等于cutoff值則判為陽性，小于cutoff值判為陰性。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。IgA-POC與IgM-ELISA方法靈敏度和特異性比較采用Z檢驗(yàn)，IgAPOC與IgA-ELISA方法的比較采用配對(duì)資料McNemar檢測(cè)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.基本情況：抽取庫存標(biāo)本458份，男性標(biāo)本241例，女性標(biāo)本215例，2份標(biāo)本缺少性別信息；年齡（38.2±12.3）歲。未感染梅毒148份、既往感染梅毒147份、早期現(xiàn)癥梅毒163份（表1）?，F(xiàn)癥梅毒組有9例RPR陰性、IgM-ELISA陽性，其余154例RPR滴度在1∶8至1∶256之間，其中1∶16、1∶32及1∶64這3個(gè)滴度標(biāo)本占全部標(biāo)本80%左右。

2.IgA-POC與IgM-ELISA、IgA-ELISA檢測(cè)結(jié)果比較：3份標(biāo)本（0.65%）未出現(xiàn)質(zhì)控線，沒有納入最終IgA評(píng)估，455份血清用于檢測(cè)，結(jié)果見表2。IgM-ELISA試劑檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)在灰區(qū)16份，占總標(biāo)本的3.52%（16/455）。IgA-POC對(duì)早期現(xiàn)癥感染診斷的靈敏度（92.64%）高于IgM-ELISA（Z=6.88，P＜0.05）；對(duì)既往感染排除診斷的特異性（72.22%）低于IgMELISA（Z=6.18，P＜0.05）；對(duì)未感染排除診斷的特異性（97.97%）與IgM-ELISA相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.16，P=0.25）。IgA-POC對(duì)非早期現(xiàn)癥梅毒排除診斷的特異性為85.27%，約登指數(shù)為64.86%；IgM-ELISA的特異性為99.32%，約登指數(shù)為58.83%。

IgA-ELISA與IgA-POC的檢測(cè)能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（McNemarχ2=11.70，P=0.00）（表3）。IgA-POC對(duì)早期現(xiàn)癥感染診斷的靈敏度及對(duì)既往感染排除診斷的特異性與IgAELISA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z值分別為0.21、0.26，P＞0.05），但對(duì)未感染排除診斷的特異性高于IgA-ELISA（Z=4.68，P＜0.05）；對(duì)非早期現(xiàn)癥梅毒排除診斷的特異性為75.34%，低于IgA-POC的97.97%，約登指數(shù)為45.48%。

表1 458份血清標(biāo)本IgM-ELISA、梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）結(jié)果

表2 IgA快速檢測(cè)試劑（IgA-POC）、IgM-ELISA、IgA-ELISA對(duì)不同感染狀態(tài)的梅毒血清標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果比較［例（%）］

三、討論

梅毒特異性IgM和IgA可隨著感染的時(shí)間及治療而逐漸消失［4］，且分子量比較大難以通過胎盤屏障［5］，因此IgM和IgA抗體的檢測(cè)可用于梅毒的早期診斷。本研究利用庫存標(biāo)本對(duì)梅毒IgA-POC進(jìn)行了早期現(xiàn)癥梅毒診斷的應(yīng)用性評(píng)估，結(jié)果顯示，該試劑對(duì)早期現(xiàn)癥梅毒的發(fā)現(xiàn)能力達(dá)93%，對(duì)未感染梅毒和既往感染梅毒的排除率分別達(dá)98%和72%。目前IgA-POC尚處于研發(fā)階段，對(duì)現(xiàn)癥梅毒診斷特異性和靈敏度尚不能與美國Chembio公司梅毒雙檢的方法相媲美［6］，但基本符合WHO對(duì)于新開發(fā)的POC試劑要求（臨床靈敏度和特異性均大于80%）。由于該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行，所需實(shí)驗(yàn)室條件和設(shè)備要求不高，因此可以在實(shí)驗(yàn)室條件簡(jiǎn)陋的診所或現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中推廣。

由于IgM在感染者體內(nèi)消失得較快，IgM-ELISA對(duì)早期現(xiàn)癥感染的檢測(cè)靈敏性低，應(yīng)用該方法進(jìn)行現(xiàn)癥梅毒篩查時(shí)常會(huì)出現(xiàn)漏診［7］，因此IgA檢測(cè)是對(duì)IgM檢測(cè)診斷早期梅毒的有效補(bǔ)充。而本研究通過對(duì)IgA-POC與IgA-ELISA的比較發(fā)現(xiàn)，IgA-POC檢測(cè)未感染排除診斷的特異性高于IgAELISA，這可能與兩種方法的操作過程有關(guān)：IgA-POC抗原包被過程是通過膠體金劃線儀將抗原劃至硝酸纖維膜上，而IgA-ELISA主要通過排槍移液器吸附至96孔板；IgA-POC的檢測(cè)為兩步法，而IgA-ELISA涉及的步驟較為繁瑣，沒有實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，增加了人為因素的干擾。

本研究使用的是庫存標(biāo)本，缺少臨床診斷相關(guān)信息，因此可能存在錯(cuò)誤分組的情況，影響對(duì)該試劑的靈敏度和特異性的計(jì)算，需要進(jìn)一步開展多中心臨床標(biāo)本評(píng)估。

表3 IgA-ELISA與IgA快速檢測(cè)試劑（IgA-POC）檢測(cè)結(jié)果比較