他克莫司對γ干擾素刺激HaCaT細胞分泌趨化因子CXCL9和CXCL10的影響及機制研究

楊賽琳 許文 林福全 周妙妮 許愛娥

310009杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院皮膚科

白癜風(fēng)是以Th1型細胞為主介導(dǎo)的疾病，γ干擾素（IFN-γ）是Th1淋巴細胞分泌的重要細胞因子之一，IFN-γ與受體結(jié)合后，促發(fā)Janus激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活物（JAK-STAT）級聯(lián)反應(yīng)，促動JAKS和STAT磷酸化，誘導(dǎo)趨化因子表達［1］。趨化因子受體3及其配體CXCL9和CXCL10被認為是在白癜風(fēng)等自身免疫和炎癥過程中促進T細胞遷移最相關(guān)的趨化因子軸之一［2］。CXCL9、CXCL10等在白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［3-5］。在白癜風(fēng)患者血清中CXCL9和CXCL10比健康人高，血清CXCL10可能是監(jiān)測疾病活動和指導(dǎo)進展期白癜風(fēng)治療的新型生物標(biāo)志物［6］。與健康人相比，在白癜風(fēng)患者病灶周圍皮膚中CXCL10和IFN-γ表達增加［2］。他克莫司（tacrolimus）是一種免疫調(diào)節(jié)劑，臨床上已證明其治療白癜風(fēng)有效［7］。Tu等［1］研究表明，他克莫司對HaCaT細胞IFN-γ相關(guān)細胞因子產(chǎn)生影響。他克莫司下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的IFN-γ受體α、磷酸化Janus激酶2（pJAK2）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（pSTAT-1）和CXCL8表達。尚未見他克莫司對HaCaT細胞中IFN-γ誘導(dǎo)的趨化因子CXCL9、CXCL10及Janus激酶1信號途徑的影響。本研究采用實時熒光定量PCR及Western印跡法檢測他克莫司對IFN-γ刺激HaCaT細胞分泌CXCL9、CXCL10及相關(guān)信號途徑關(guān)鍵蛋白的影響，為他克莫司治療白癜風(fēng)作用機制的研究提供依據(jù)。

一、材料

他克莫司由海正藥業(yè)杭州有限公司生產(chǎn)（批號TAB0160901，純度99.1%），rhIFN-γ為美國Perpotech公司產(chǎn)品，人角質(zhì)形成細胞株HaCaT購于上海博谷生物科技有限公司，MTT、胎牛血清為美國Gbico公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒為美國羅氏公司產(chǎn)品，CXCL9、CXCL10引物由廣州復(fù)能公司設(shè)計合成。CXCL9、CXCL10抗體、ELISA試劑盒為美國Abcam公司產(chǎn)品，蛋白提取試劑盒、蛋白MARK為美國Fermentes公司產(chǎn)品。

二、方法

1.MTT法：取對數(shù)生長期HaCaT細胞，按1×105/ml濃度接種入96孔板，每孔100 μl。用二甲基亞砜（DMSO）配制他克莫司成1 kg/L溶液，用培養(yǎng)液稀釋至1、10、20、40、60、80、100、120 mg/L，處理細胞，與空白對照組同置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。加入MTT溶液（5 g/L）10 μl/孔，4 h后棄上清液，加入DMSO 100 μl/孔，振蕩10 min，置酶標(biāo)儀于490 nm波長測吸光度（A值）。每組設(shè)3個復(fù)孔。細胞存活率=實驗組A490/對照組A490×100%。

2.熒光定量PCR檢測CXCL9、CXCL10 mRNA表達：分為空白對照組、IFN-γ組、他克莫司組及他克莫司+IFN-γ組。根據(jù)MTT結(jié)果選擇20 mg/L他克莫司預(yù)處理HaCaT細胞4 h，用500 U/ml IFN-γ刺激細胞12 h，熒光定量PCR測定4組細胞內(nèi)CXCL9、CXCL10 mRNA含量，嚴格按試劑盒步驟操作。

3.Western印跡法檢測 CXCL9、CXCL10、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達：分組同熒光定量PCR檢測。20 mg/L他克莫司處理4 h，500 U/ml IFN-γ處理48 h。收集細胞，蛋白裂解液裂解，離心后收集上清液提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，每組各取50 μg總蛋白樣品，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室溫4℃封閉1 h，一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗IgG抗體室溫孵育1 h，與ECL顯色劑以1∶1比例混合后孵育1 min，用保鮮膜包被后轉(zhuǎn)X線片曝光3 min。以β肌動蛋白及磷酸化總蛋白為內(nèi)參照。重復(fù)3次，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白表達情況。

4.ELISA法檢測HaCaT細胞上清液中CXCL9、CXCL10蛋白。分組處理同熒光定量PCR檢測。實驗嚴格按照試劑盒說明書操作。

5.統(tǒng)計方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料采用±s，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組樣本采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.不同濃度他克莫司對HaCaT細胞增殖的影響：0、1、10、20、40、60、80、100、120 mg/L他克莫司處理4 h后，HaCaT細胞存活率分別為100%、85%、96%、90%、67%、13%、13%、12%、13%。與空白對照組比較，40～120 mg/L他克莫司對HaCaT細胞增殖有明顯抑制作用（均P＜0.05）；0～20 mg/L他克莫司對HaCaT細胞增殖無顯著影響（P＞0.05）。

2.他克莫司對HaCaT細胞CXCL9、CXCL10 mRNA表達的影響：與空白對照組比較，IFN-γ組能明顯增加CXCL9、CXCL10 mRNA表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與IFN-γ組比較，20 mg/L他克莫司能明顯抑制IFN-γ刺激后細胞CXCL9、CXCL10 mRNA的表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

3.他克莫司對HaCaT細胞CXCL9、CXCL10及p-JAK1、p-STAT1蛋白表達的影響：見表2、圖1。與空白對照組比較，IFN-γ組明顯增加CXCL9、CXCL10及p-JAK1、p-STAT1蛋白表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與IFN-γ組比較，20 mg/L他克莫司明顯抑制IFN-γ刺激后細胞CXCL9、CXCL10、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

4.他克莫司對HaCaT細胞培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白含量的影響：見表2。與空白對照組比較，IFN-γ組明顯增加細胞培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白的含量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與IFN-γ組比較，20 mg/L他克莫司能明顯抑制IFN-γ刺激后細胞培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白含量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 20 mg/L他克莫司處理對500 U/ml γ干擾素刺激HaCaT細胞CXCL9、CXCL10 mRNA表達的影響（±s）

表1 20 mg/L他克莫司處理對500 U/ml γ干擾素刺激HaCaT細胞CXCL9、CXCL10 mRNA表達的影響（±s）

注：n=3。各組與空白對照組比較，aP＜0.01。各組與γ干擾素組比較，bP＜0.01

組別空白對照組γ干擾素組他克莫司組他克莫司+γ干擾素組CXCL9 1 10 369.08±7.99a5 166.6±3.01a b5 914.33±4.59bCXCL10 1 290.02±2.16a176.68±0.74a b114.96±0.73b

四、討論

白癜風(fēng)的治療是一個挑戰(zhàn)。糖皮質(zhì)激素是最常用的藥物，但長期大量使用會引起皮膚萎縮、毛細血管擴張、多毛癥和痤瘡等。他克莫司治療白癜風(fēng)，尤其是面頸部白癜風(fēng)療效好，安全性高，長期使用不會有外用糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)［8］。Lan等［9］認為，他克莫司可通過刺激角質(zhì)形成細胞釋放干細胞生長因子，從而促進黑素細胞增殖。Kang等［10］發(fā)現(xiàn)，他克莫司可通過刺激酪氨酸酶活性和表達來促進黑素細胞色素生成和遷移。

本研究結(jié)果顯示，IFN-γ對CXCL9和CXCL10基因表達的影響不同，CXCL9的表達量豐度比CXCL10高，該結(jié)果與文獻報道一致。20 mg/L他克莫司能抑制HaCaT細胞中IFN-γ誘導(dǎo)的CXCL9、CXCL10的基因表達。CXCL9基因相對表達量減少43%，CXCL10基因相對表達量減少60%，表明他克莫司對CXCL10基因表達的抑制作用更強，具體原因有待進一步研究。20 mg/L他克莫司能抑制HaCaT細胞中JAK1及STAT1磷酸化；能抑制HaCaT細胞內(nèi)與培養(yǎng)上清液中IFN-γ誘導(dǎo)的CXCL9、CXCL10蛋白表達。本研究為進一步闡明他克莫司治療白癜風(fēng)的作用機制及他克莫司的臨床應(yīng)用提供了一定實驗依據(jù)。

圖1 20 mg/L他克莫司對HaCaT細胞CXCL9、CXCL10、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達的影響 1：空白對照組；2：500 U/ml γ干擾素組；3：他克莫司組；4：他克莫司+γ干擾素組

表2 20 mg/L他克莫司對HaCaT細胞及其培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白表達的影響（灰度值，±s）

表2 20 mg/L他克莫司對HaCaT細胞及其培養(yǎng)上清液CXCL9、CXCL10蛋白表達的影響（灰度值，±s）

注：n=3。各組與空白對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；各組與γ干擾素組比較，cP＜0.01

組別HaCaT細胞空白對照組γ干擾素組他克莫司組他克莫司+γ干擾素組CXCL9 6.18±0.06 8.47±0.29b6.69±0.27a c7.36±0.13cCXCL10 7.58±0.11 7.87±0.17a7.18±0.07b c7.36±0.09cp-JAK1 2.59±0.18 4.20±0.18b1.23±0.11b c2.60±0.16cp-STAT1 2.36±0.05 4.29±0.11b2.04±0.07b c3.62±0.19c培養(yǎng)上清液CXCL9 79.59±0.27 1 213.36±0.95b699.59±0.69b c426.45±0.31cCXCL10 148.92±0.25 1 722.41±2.57b464.98±0.53b c554.12±0.56c