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    中國(guó)沙棘葉薄層色譜鑒別的提高研究

    2018-06-13 08:41:10趙彩云蘇錦松劉川張藝
    中藥與臨床 2018年1期
    關(guān)鍵詞:異鼠李素沙棘

    趙彩云,蘇錦松,劉川,張藝

    沙棘葉收載于《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2014年版),為胡頹子科植物中國(guó)沙棘(Hippophae rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi)、云南沙棘(Hippophae rhamnoidesL.subsp.yunnanensis Rousi)的干燥葉,具有健脾消食,止咳祛痰和活血散瘀的功效,用于治脾虛食少,食積腹痛、咳嗽痰多、胸痹心痛、瘀血經(jīng)閉及跌撲瘀腫[1]。前期研究表明,沙棘葉次生代謝產(chǎn)物主要為黃酮類成分,包括異鼠李素、山柰素和槲皮素及其苷類成分等,黃酮類化合物具有改善微循環(huán)、改變體內(nèi)酶活性、降血脂、降膽固醇、抗自由基、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎癥等藥理作用[2]?!端拇ㄊ〔厮幉臉?biāo)準(zhǔn)》(2014年版)中沙棘葉的薄層鑒別項(xiàng)僅對(duì)槲皮素和異鼠李素兩種黃酮苷元成分進(jìn)行定性鑒別,且異鼠李素拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重,見圖1。為了提高鑒別的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)以野生資源量大,中國(guó)特有的中國(guó)沙棘為研究對(duì)象,同時(shí)以槲皮素、異鼠李素以及山奈素三種黃酮苷元為對(duì)照品,研究建立了中國(guó)沙棘葉的薄層色譜鑒別法,以期提高現(xiàn)有法定標(biāo)準(zhǔn)中沙棘葉的薄層色譜鑒別方法。

    圖1 《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2014年版)中沙棘葉TLC圖

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

    共12 批次,采自四川、西藏及甘肅(見表1),經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院張藝研究員鑒定其基原為胡頹子科沙棘屬中國(guó)沙棘 (H.rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi)的葉片,新鮮葉片采集后立即用硅膠干燥。

    表1 12批次中國(guó)沙棘葉樣品信息表

    1.2 儀器

    ZF-20D型暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠);KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Sartorius BP121s型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);ULUP-I-10T型優(yōu)普超純水機(jī)(成都超純科技有限公司);DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

    1.3 試藥

    槲皮素對(duì)照品(批號(hào):MUST-150907,純度:99.35%)、山柰素對(duì)照品(純度:99.26%)和異鼠李素對(duì)照品(純度:99.13%),以上對(duì)照品均購自成都曼思特生物科技有限公司,其余試劑為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 方法

    2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇超聲溶解,分別配置為0.468 mg﹒mL-1、0.256 mg﹒mL-1、0.196 mg﹒mL-1的對(duì)照品溶液。

    2.1.2 供試品溶液的制備 取中國(guó)沙棘葉粉末(過三號(hào)篩)約1.0 g,置具塞錐形瓶中,加入甲醇40 mL,稱定重量,以70 ℃加熱回流提取1 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過。取續(xù)濾液20 mL置具塞錐形瓶中,加鹽酸3mL,在75 ℃水浴中加熱水解30 min,立即冷卻,濾過。取濾過液10 mL,蒸干,加水15 mL溶解,用乙酸乙酯萃取2次,每次20 mL,合并乙酸乙酯溶液,水浴蒸干,殘?jiān)蛹状? mL溶解,作為供試品溶液。

    2.1.3 顯色劑的制備 稱取三氯化鋁1 g,加乙醇100 mL溶解制成l%的三氯化鋁乙醇溶液。

    2.1.4 TLC 鑒別 按照薄層色譜法(2015版《中國(guó)藥典》通則0502)試驗(yàn)[3],吸取對(duì)照品溶液1 μL、供試品溶液2 μL,分別點(diǎn)于同一實(shí)驗(yàn)室自制的含3%醋酸鈉溶液制備的硅膠G 薄層板上,以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(6 : 4 : 1.5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以1 %三氯化鋁試液,熱風(fēng)吹干,置紫外光燈(365 nm)下觀察,結(jié)果見圖2。

    圖2 中國(guó)沙棘葉TLC圖

    2.2 方法耐用性考察

    2.2.1 不同溫度的考察 分別考察了不同溫度(4 ℃、20 ℃、35 ℃)對(duì)薄層鑒別的影響,結(jié)果見圖3。

    圖3 不同溫度條件考察的薄層色譜圖(UV365nm下檢視)

    從圖3可知:在不同溫度4 ℃、20 ℃和35 ℃下,對(duì)照品溶液與供試品溶液薄層色譜圖斑點(diǎn)無明顯拖尾現(xiàn)象,均能實(shí)現(xiàn)分離,但溫度過低時(shí)易形成邊緣效應(yīng)。相比較而言,20 ℃能達(dá)到很好的分離效果,說明該薄層鑒別方法的耐用性良好。

    2.2.2 不同相對(duì)濕度的考察 分別考察了不同相對(duì)濕度(18%、32%、56%)對(duì)薄層鑒別的影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 不同濕度條件考察的薄層色譜圖(UV365nm下檢視)

    從圖4可知,在低、中、高不同相對(duì)濕度18%、32%、56% 的條件下展開,對(duì)照品溶液與供試品溶液薄層色譜圖斑點(diǎn)無明顯拖尾現(xiàn)象,均能實(shí)現(xiàn)分離,相比較而言,32%能達(dá)到很好的分離效果,說明該薄層鑒別方法的耐用性良好。

    2.3 不同批次中國(guó)沙棘葉的薄層色譜鑒別

    按照上述確定的薄層鑒別條件,進(jìn)行12批次不同產(chǎn)地中國(guó)沙棘葉的薄層色譜鑒別,結(jié)果顯示供試品溶液薄層色譜圖中,在與對(duì)照品溶液薄層色譜的相應(yīng)位置上,顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。色譜圖見圖5。

    圖5 12批次不同產(chǎn)地中國(guó)沙棘葉的薄層鑒別色譜圖(UV365nm下檢視)

    3 討論

    3.1 展開劑的選擇

    主要考察了3個(gè)展開系統(tǒng):(1)三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(6:4:1.5);(2)三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(5:4:1);(3)甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1),結(jié)果表明,展開系統(tǒng)(2)中異鼠李素拖尾較嚴(yán)重,展開系統(tǒng)(3)中山柰素和異鼠李素未完全分開,綜合考慮,確定三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(6:4:1.5)為中國(guó)沙棘葉的薄層色譜鑒別條件。

    3.2 薄層板的選擇

    主要考察了硅膠G板、聚酰胺薄膜和含3%醋酸鈉的硅膠G板對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,硅膠G板的薄層色譜圖中山柰素和異鼠李素很難進(jìn)行分離,聚酰胺薄膜的薄層色譜圖中對(duì)照品及供試品拖尾現(xiàn)象均較嚴(yán)重。

    3.3 樣品溶液的制備

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,供試品溶液的薄層色譜圖中接近溶劑前沿的部分有較多的紅色斑點(diǎn),猜測(cè)很有可能為沙棘葉中的葉綠素類等脂溶性成分,在后期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定中,可考慮在樣品處理過程中增加石油醚除雜的操作。

    本實(shí)驗(yàn)利用三種黃酮類成分對(duì)中國(guó)沙棘葉進(jìn)行薄層色譜的研究和分析,所建立的薄層色譜定性鑒別方法準(zhǔn)確、可靠、適用性強(qiáng),可以此對(duì)中國(guó)沙棘葉藥材進(jìn)行科學(xué)的質(zhì)量控制。

    [1]四川省食品藥品監(jiān)督管理局.四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)(2014年版)[M].成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社, 2014:87-91.

    [2]曹緯國(guó),劉志勤,邵云,等.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2003,23(12): 2241-2247.

    [3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.

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