CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及其在動(dòng)物細(xì)胞系構(gòu)建中的應(yīng)用

葛玉鳳 安芳蘭 劉學(xué)榮 崔治亮 田波

摘要?CRISPR/Cas9[Clustered ?regular ?interspaced ?short ?palindromic ?repeats（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9]系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古生菌中可降解入侵病毒和噬菌體DNA的一種基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，由于其具有快速、精準(zhǔn)、高效，易于設(shè)計(jì)，且特異性高等優(yōu)勢(shì)，得到了廣泛的應(yīng)用。概述了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程，并介紹其結(jié)構(gòu)和編輯原理、在動(dòng)物細(xì)胞系構(gòu)建中的應(yīng)用及展望，以便為更合理地應(yīng)用和改進(jìn)該技術(shù)提供系統(tǒng)的文獻(xiàn)參考。

關(guān)鍵詞?CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù);動(dòng)物細(xì)胞系;構(gòu)建

中圖分類號(hào)?Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2018）35-0009-02

1?CRISPR/Cas9的基因座結(jié)構(gòu)和編輯原理

20世紀(jì)80年代，日本學(xué)者Nakata在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)了一系列的短的間隔序列[1]，但其功能一直未研究清楚。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中，2002年將其正式命名為CRISPR。直到2008 年，CRISPR/Cas9才被證明具有免疫能力，在E.coli中成熟的crRNAs引導(dǎo)形成Cas蛋白復(fù)合體，從而抑制病毒的增殖[2]。2012年，由RNA介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9正式建立，并完成了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因組編輯[3-5] 。

基因編輯技術(shù)是通過(guò)基因的定點(diǎn)突變，以小片段的刪除及目的基因的插入等方式對(duì)基因組進(jìn)行精確修飾的一種技術(shù)，是研究基因功能的重要手段?；蚓庉嫾夹g(shù)經(jīng)歷了一個(gè)長(zhǎng)期而艱巨的研發(fā)歷程，鋅指核酸酶（ZFNs）是第一代人工核酸內(nèi)切酶，較傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)易于操作，效率高，周期短，曾被應(yīng)用于動(dòng)物和細(xì)胞的定點(diǎn)修飾和基因敲除，但隨著基因研究技術(shù)的發(fā)展，ZFNs技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在制備繁瑣，效能低，成本高的缺點(diǎn)，因此，TALEN技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。2011年，TALEN技術(shù)成功應(yīng)用于目的基因的編輯[6-8]，該技術(shù)應(yīng)用簡(jiǎn)單高效，細(xì)胞毒性較小，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物細(xì)胞、人細(xì)胞及斑馬魚等模式生物的研究中，但該技術(shù)的靶點(diǎn)模塊建立較復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。截至2013年，Cong和Mali將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于人類和小鼠基因組編輯，第三代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)- CRISPR/Cas9技術(shù)誕生，并迅速成為各國(guó)學(xué)者研究的重點(diǎn)基因編輯技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各種模式動(dòng)物模型和細(xì)胞系的建立。

CRISPR/Cas9是存在于大多數(shù)細(xì)菌和古生菌中的一種獲得性免疫系統(tǒng)。由多個(gè)重復(fù)序列和非重復(fù)的間隔序列組成，主要包括R-S結(jié)構(gòu)和編碼cas的基因操作子。R-S結(jié)構(gòu)具有特異性識(shí)別外源DNA的功能，cas基因家族可編碼多功能的CRISPR蛋白，并與成熟的crRNA共同作用[9]構(gòu)建抵御外來(lái)病毒入侵的免疫屏障。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中cas蛋白的不同，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3 種類型。I型和III型CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白的參與，Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需要Cas9蛋白即可對(duì)DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾，是目前研究的最徹底，也是應(yīng)用最為廣泛的。其作用機(jī)制主要通過(guò)三個(gè)階段實(shí)現(xiàn)：獲得CRISPR可變間隔序列、轉(zhuǎn)錄crRNA前體與加工crDNA、crRNA-tracrRNA-Cas9復(fù)合體剪輯外源性DNA[10]。與傳統(tǒng)的ZFN、TALEN基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)設(shè)計(jì)不同的RNA向?qū)?duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，操作簡(jiǎn)單易行，高效，基因修飾可遺傳，無(wú)物種限制，實(shí)驗(yàn)周期較短，成本較低，對(duì)細(xì)胞毒性較小，適合于多基因、高通量的操作，可應(yīng)用在各種不同的細(xì)胞和模式生物中，且發(fā)生同源重組的概率比自然發(fā)生同源重組的概率高。

2?CRISPR/Cas9技術(shù)在動(dòng)物細(xì)胞系構(gòu)建中的應(yīng)用

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究深入和不斷完善，該技術(shù)已成為動(dòng)植物基因功能研究、建立細(xì)胞系和疾病模型的主要手段，尤其在動(dòng)物細(xì)胞系的建立方面起到了重要的作用，目前，該技術(shù)在動(dòng)物細(xì)胞系建立中的應(yīng)用主要包括基因敲除、基因插入和基因修飾3個(gè)方面。

2.1?基因敲除

我國(guó)科學(xué)家針對(duì)豬的酪氨酸酶、PARK2 和PINK1 基因的外顯子設(shè)計(jì)了Cas9 打靶質(zhì)粒，獲得了純合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2 和PINK1 雙基因敲除的細(xì)胞系，該細(xì)胞系用于體細(xì)胞核移植后，成功培育出酪氨酸酶基因敲除豬和PARK2 和PINK1 雙基因敲除豬，建立了人類白化病和帕金森綜合征2種豬模型，該研究團(tuán)隊(duì)首次將CRISPR/Cas9技術(shù)與體細(xì)胞克隆相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了大型家禽雙基因的等位敲除，這對(duì)于人類遺傳性疾病的研究有重大意義[11]。近期，又有中國(guó)學(xué)者通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建了酪氨酸酶（TYR）等位基因突變的豬胎兒成纖維細(xì)胞系和PARK2 和PINK1雙基因knock-out 的細(xì)胞系，成功培養(yǎng)出基因突變的個(gè)體，并可穩(wěn)定遺傳給下一代。韓秋影等[12]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平的基因敲除技術(shù)，同時(shí)構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的HEK293細(xì)胞，并運(yùn)用CRISPR/Cas9基因轉(zhuǎn)錄激活技術(shù)，使得HEK293 細(xì)胞cGAS基因的轉(zhuǎn)錄激活。MEIS2（一種高度保守的同源盒轉(zhuǎn)錄因子）可廣泛調(diào)控胚胎的早期發(fā)育和腫瘤的發(fā)生，研究者[13]通過(guò)設(shè)計(jì)2個(gè)靶向sgRNA，介導(dǎo)外源Cas9蛋白與基因特異性位點(diǎn)結(jié)合，構(gòu)建了可穩(wěn)定敲除MEIS2基因的HEK293T細(xì)胞株。

2.2?基因敲入

傳統(tǒng)的基因定點(diǎn)敲入是通過(guò)同源重組的方式將目的基因整合到細(xì)胞基因組中，篩選產(chǎn)量較高的單克隆，但此方法無(wú)法精確控制基因的插入位點(diǎn)，因此整合效率較低。CRISPR/Cas9 技術(shù)為構(gòu)建穩(wěn)定高產(chǎn)的重組細(xì)胞提供了可行性。有研究發(fā)現(xiàn)CTCF（脊椎動(dòng)物關(guān)鍵的絕緣子蛋白）對(duì)動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控起著重要的作用，其缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎死亡。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，將MD（有絲分裂期特異性降解結(jié)構(gòu)域）敲入CTCF表達(dá)框上游，從而帶動(dòng)CTCF蛋白周期性持續(xù)降解，獲得了CTCF蛋白特異性降解細(xì)胞系[14]，體現(xiàn)了CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)基因組改造的簡(jiǎn)易性和特異性。段宇紅[15]等將4種不同的表達(dá)PCV2（豬圓環(huán)病毒）功能蛋白基因定點(diǎn)插入到PK15細(xì)胞的Rosa26位點(diǎn)，從而建立了穩(wěn)定的可表達(dá)PCV2的細(xì)胞系，為研究PCV2病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制水平低的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

2.3?基因修飾

WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，目前世界上有近6 000多種疾病與基因發(fā)生異常相關(guān)，但在臨床上仍缺乏有效的治療體系，由于干細(xì)胞具有較強(qiáng)的可塑性和重建能力，因此干細(xì)胞基因修飾技術(shù)成為構(gòu)建疾病模型、篩選靶向藥物和制備治療型干細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù)，也成為了人類基因疾病治療的新希望。王曄博[16]等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯原理，在人的多功能干細(xì)胞WAN基因第6個(gè)內(nèi)含子的高突變位點(diǎn)區(qū)域，設(shè)計(jì)了2個(gè)gRNAs，通過(guò)IDLV攜帶模板序列的方法篩選出了同源重組子，其正確率達(dá)50%，有效優(yōu)化了人多功能干細(xì)胞中基因編輯效率，為研究發(fā)育生物學(xué)和某些疾病的機(jī)理提供了操作平臺(tái)。有學(xué)者[17]利用Cas9核酸酶在sgRNA 介導(dǎo)下可引起基因組DNA雙鏈斷裂，從而形成同源重組修復(fù)的特性，構(gòu)建了綠色熒光標(biāo)記的CD34報(bào)告基因293AD細(xì)胞系，為后續(xù)人體細(xì)胞誘導(dǎo)去分化成造血干細(xì)胞提供了有利的工具。韓笑等[18]利用gRNA定位，引導(dǎo)Cas9蛋白精確定位進(jìn)行DNA剪切，并啟動(dòng)DNA自我修復(fù)機(jī)制，建立了能穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的小鼠胚胎干細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)編輯，同時(shí)運(yùn)用Cas9核酸酶在DNA雙鏈上精確剪切DNA，降低了Cas9剪切DNA的脫靶率，有效提高了應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯的效率。

因此，高效的基因編輯技術(shù)和精確的基因操作方法為構(gòu)建所需的細(xì)胞系提供了必要的手段。目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)作為近幾年興起的第三代基因編輯技術(shù)，日漸廣泛應(yīng)用于病毒基因組的編輯、細(xì)胞系的建立及人類疾病模型的研究等各領(lǐng)域，提供了一種簡(jiǎn)單高效的基因重組的篩選方法，極大地推動(dòng)了基因工程技術(shù)的應(yīng)用研究。

3?展望

CRISPR/Cas9 技術(shù)已開(kāi)發(fā)為具有多功能的技術(shù)，但在長(zhǎng)期的研究應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9 技術(shù)在動(dòng)植物細(xì)胞基因改造及其他應(yīng)用方面存在著脫靶的風(fēng)險(xiǎn)。而且在基因編輯過(guò)程中，CRISPR/Cas9產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的同時(shí)可能激活p53蛋白通路，從而導(dǎo)致基因編輯失敗，在臨床治療中產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，結(jié)合以上對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和編輯原理、在動(dòng)物細(xì)胞系建立中的應(yīng)用及存在的問(wèn)題等現(xiàn)狀的分析，可進(jìn)一步完善CRISPR/Cas9系統(tǒng)在干細(xì)胞中的同源修飾效率、在干細(xì)胞中對(duì)遺傳性P-globing異常疾病的基因治療及p53基因功能監(jiān)控等方面的研究，最終為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病研發(fā)、精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化醫(yī)療提供服務(wù)。

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