基于SSR的高粱光敏特性分析

牛皓 平俊愛 張福耀 呂鑫 杜志宏 李慧明 王玉斌

摘要?[目的]探明控制高粱抽穗期基因的遺傳機(jī)理，為高粱品種選育提供新思路新方法。[方法]利用已知抽穗性狀的3個(gè)高粱材料晉粱五、Ma、IS722，對(duì)144對(duì)SSR引物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，分析差異，篩選光敏感特異性引物。[結(jié)果]有4對(duì)引物產(chǎn)生特異性條帶，分別為xtxp217、xtxp12、xtxp15、xtxp4，且片段大小在100 bp左右，其中xtxp217位于10號(hào)染色體、xtxp12位于4號(hào)染色體、xtxp15位于5號(hào)染色體、xtxp4位于2號(hào)染色體。[結(jié)論]該研究為后續(xù)對(duì)高粱雜交種進(jìn)行光敏鑒定提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?高粱;光敏感;SSR

中圖分類號(hào)?S514文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2018）35-0097-03

高粱是一種起源于東非的熱帶短日照單子葉C4植物，自8 000多年前在埃塞俄比亞和蘇丹被馴化后作為食物、飼料、纖維和燃料被廣泛種植在全球范圍內(nèi)的不同氣候帶[1]。由于高粱具有高產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)、抗旱、耐鹽、耐堿等特性，因而被認(rèn)為是未來最有價(jià)值的作物[2-3]。時(shí)至今日在西非和中非，高粱依然作為大宗的進(jìn)口糧食來保障數(shù)百萬人民的溫飽[4]。高粱的種類比較廣泛，包括飼草高粱、釀造高粱、糖高粱等，這些不同的高粱分類一定程度上是由影響高粱抽穗期的環(huán)境因素決定的。

高粱抽穗期通常用播種到抽穗的天數(shù)來表示[4]。高粱抽穗期的合理調(diào)控對(duì)現(xiàn)代育種工作的成效至關(guān)重要，特別是作為青貯飼料用途的飼草高粱，對(duì)光照條件要求比較嚴(yán)格，當(dāng)生長環(huán)境的光照時(shí)長超過12.2 h則不抽穗，始終維持營養(yǎng)生長狀態(tài)，生物產(chǎn)量比非光敏飼草高粱要高，同時(shí)牲畜的適口性和消化率較普通高粱好[5-10]。高粱全基因組測序工作已完成，分子輔助育種技術(shù)的應(yīng)用對(duì)了解抽穗期的調(diào)控基因和調(diào)控機(jī)理進(jìn)而實(shí)現(xiàn)“訂單化”育種有著重要的意義[11-14]。筆者以3個(gè)具有代表性的高粱材料為研究對(duì)象，提取DNA，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)144對(duì)與高粱抽穗期相關(guān)的SSR引物進(jìn)行鑒別，分析差異，篩選光敏感特異性引物，為選育光敏型飼草高粱提供新思路、新方法。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?高粱材料。3份高粱材料，分別為釀造粒用高粱晉粱五，飼草高粱IS722，光敏感普通高粱Ma。

1.1.2?SSR引物。通過查閱文獻(xiàn)共搜集到144對(duì)分布于高粱10條染色體上的SSR引物，其中有111對(duì)明確位置，另有33對(duì)沒有查詢到具體定位。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成（表1）。

1.2?方法

1.2.1?育苗。將晉粱五、Ma、IS722這3個(gè)材料分別種植于鋪有營養(yǎng)土的96孔育苗盤中，澆足底墑水，待3～4片葉時(shí)，用剪刀剪下足量葉片置于2 mL離心管中，液氮速凍后備用。

1.2.2?DNA提取。3個(gè)材料DNA提取是采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒完成的，經(jīng)過純度和濃度檢測后置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.3?PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在Thermal Cycler C1000 touch擴(kuò)增儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)總體系是10 μL，DNA模板1 μL，前后引物共1 μL，Taq PCR Master Mix 3 μL，ddH2O補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)體系為94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸10 min。4 ℃待機(jī)備用。

1.2.4?聚丙烯酰胺凝膠電泳。將晉粱五、Ma、IS722這3個(gè)高粱恢復(fù)系材料，按照此順序組成1組，每組對(duì)應(yīng)1對(duì)引物。電泳版用雙蒸水清洗瀝干，1%瓊脂糖封底待用;30%的丙烯酰胺溶液15 mL，10×TBE溶液6 mL，雙蒸水24 mL，20%過硫酸銨300 μL，TEMED溶液30 μL，各成分稱量好，待封底瓊脂糖凝固后，灌膠，點(diǎn)樣，電壓220 V，100 min。

試驗(yàn)選用生工生物工程（上海）股份有限公司50～1 000 bp DNA Ladder-H2作為參照，跑膠結(jié)束后用干凈玻璃板鋪平，拍照分析。

2?結(jié)果與分析

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果出現(xiàn)多態(tài)性條帶的共96組即96對(duì)引物，與maker對(duì)照出現(xiàn)特異性條帶的引物共有4對(duì)，其余組引物并未出現(xiàn)明顯多態(tài)性。

這4對(duì)引物分別為xtxp217、xtxp12、xtxp15、xtxp47。對(duì)應(yīng)序列分別為F：5′-GGCCTCGACTACGGAGTT-3′，R：5′-TCGGCATATTGATTTGGTTT-3′;F：5′-AGATCTGGCGGCAACG-3′，R：5′-AGTCACCCATCGATCATC-3′;F：5′-CACAAACACTAGTGCCTTATC-3′，R：5′-CATAGACACCTAGGCCATC-3′;F：5′-CAATGGCTTGCACATGTCCTA-3′，R：5′-GGTGCGAGCTAGTTAAGTGGG-3′。

3?結(jié)論與討論

結(jié)果表明，產(chǎn)生特異性條帶的引物分別為xtxp217、xtxp12、xtxp15、xtxp4，且片段大小在100 bp左右，其中xtxp217位于10號(hào)染色體、xtxp12位于4號(hào)染色體、xtxp15位于5號(hào)染色體、xtxp4位于2號(hào)染色體。國外科學(xué)家對(duì)高粱的前期遺傳研究揭示了4個(gè)與開花時(shí)間（成熟度）相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，命名為Ma1、Ma2、Ma3、Ma4，其分別位于高粱的第6號(hào)、2號(hào)、1號(hào)和10號(hào)染色體上[15-19]。最近又發(fā)現(xiàn)了另外2個(gè)能增加光周期敏感性，并且能延長飼草及高生物量高粱雜交種營養(yǎng)生長時(shí)長的基因Ma5、Ma6[20]。該研究將篩選出的這4對(duì)特異性SSR引物用于后代材料的表型鑒定，通過實(shí)驗(yàn)室“預(yù)判”就可得出材料的抽穗性狀，省去田間種植鑒別環(huán)節(jié)，節(jié)省育種的成本，縮短育種時(shí)間，提高育種效率。

隨著高粱全基因組測序完成和遺傳圖譜及物理圖譜的不斷完善，通過分子輔助育種手段就可以進(jìn)一步明確與高粱抽穗期相關(guān)的基因性狀，這將在作物改良中發(fā)揮巨大的作用。另外，隨著全球煤炭、石油和天然氣等不可再生能源儲(chǔ)量的日趨減少，生物質(zhì)能源的開發(fā)和利用已經(jīng)成為全球科研焦點(diǎn)，而通過生物技術(shù)對(duì)高粱抽穗期進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而選育出的高生物量、強(qiáng)抗逆性、種植范圍廣、乙醇轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)勢品種，必將成為生物質(zhì)能源必不可少的原材料。

因此，高粱抽穗期基因表達(dá)的研究和控制，對(duì)于培育飼草高粱和對(duì)木質(zhì)素生物燃料含量要求高的生物質(zhì)高粱而言具有重要的意義[17，21]。

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