刺參多糖清除活性氧保護(hù)線粒體的研究

張紅玲，韋豪華，李興太

（大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

線粒體存在于大多數(shù)細(xì)胞中，是細(xì)胞乃至生命體進(jìn)行各類代謝活動(dòng)的中樞，它不僅為細(xì)胞提供能量，參與細(xì)胞分化與信息傳遞等過(guò)程，也是產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的最主要場(chǎng)所，還是ROS損傷的主要靶點(diǎn)，體內(nèi)外研究均表明，過(guò)多的ROS能夠攻擊膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 DNA，并使細(xì)胞的功能惡化[1]。近年來(lái)，關(guān)于ROS對(duì)健康重要性的研究越來(lái)越多。低水平的ROS對(duì)健康無(wú)害，被看做為信號(hào)分子；高水平的ROS與ROS緩沖系統(tǒng)功能障礙有關(guān)，直接或間接地參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與疾病的發(fā)生[2]。研究顯示[3,4]，電子傳遞鏈的結(jié)構(gòu)變化可使ROS生成量增加、脂質(zhì)過(guò)氧化加劇，ROS生成過(guò)量誘導(dǎo)生物分子的氧化損傷，從而導(dǎo)致線粒體衰老、癌癥與許多其他疾病。因此，體內(nèi)ROS保持平衡對(duì)健康具有重要意義[5]。海參不僅是珍貴的食品也是名貴的藥材，自古以來(lái)就被奉為營(yíng)養(yǎng)佳品，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與藥用價(jià)值。海參的營(yíng)養(yǎng)與保健作用主要源于其體內(nèi)的多糖，是由氨基半乳糖、己糖醛酸、巖藻糖、硫酸基組成[6]，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、抗腫瘤[9]和抗凝血[10]等多種生物活性，刺參被譽(yù)為“海參之冠”。李學(xué)鵬等[11]分別選用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、和菠蘿蛋白酶水解海參體壁，隨水解時(shí)間增加，5種酶解液的抗氧化能力大體上都呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)。胰蛋白酶酶解液Fe2+螯合能力最強(qiáng)；木瓜蛋白酶酶解液的還原力最大；堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解液對(duì)O2·?自由基的清除能力較強(qiáng)。許靜等[12]研究表明，從海參臟器中分離出的多糖 HPS1、HPS2可清除·OH、O2·?自由基，且抗氧化活性隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。本文采用胃蛋白酶與胰蛋白酶酶解法提取刺參粗多糖，研究了其Fe2+螯合能力、還原力及清除·OH、H2O2、O2·?等ROS保護(hù)線粒體的作用及其機(jī)制，為其在功能性食品及新藥開(kāi)發(fā)利用方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

干刺參，大連曉芹食品有限公司；SD大鼠，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；牛血清白蛋白、還原型輔酶Ⅰ(NADH)、氮藍(lán)四唑(nitrogen blue tetrazolium，NBT)，荷蘭Boehringer Mannheim公司；考馬斯亮藍(lán)G-250染色液、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)，美國(guó)Fluka公司；N-(2-羥乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)，德國(guó) Merck公司；硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、1,1,3,3-四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetrathoxypropane，TEP)，美國(guó)Sigma公司；菲洛嗪(Ferrozine)，英國(guó)Alfa Aesar公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，美國(guó)Gibco公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；TGL-18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Polystat 34恒溫水浴鍋，美國(guó)Techne公司；DY89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝科器研究所；XW-80A旋渦混合器，上海精密實(shí)業(yè)有限公司；SX-610型筆式pH計(jì)，上海三信儀表廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參粗多糖的提取

稱取刺參干粉10 g，加雙蒸水300 mL浸泡5 h；用98%濃鹽酸調(diào)刺參浸泡液pH為2.0～2.5，加胃蛋白酶1 g水浴酶解5 h；再用1 moL/L氫氧化鈉調(diào)pH為8.0～8.5，加胰蛋白酶1 g水浴酶解5 h；于90 ℃水浴5 min，冷卻后用98%濃鹽酸調(diào)pH至7；將酶解液8000 r/min離心15 min，上清用95%乙醇溶液調(diào)至含75%的乙醇，8000 r/min離心15 min，收集沉淀烘干后稱重，即得刺參粗多糖（Stichopus japonicus polysaccharides，SJP）。采用硫酸苯酚法[13]測(cè)定 SJP多糖含量。

1.2.2 線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的測(cè)定

1.2.2.1 丙二醛(MDA)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

用TBA顯色法測(cè)定[14]，利用TEP在酸性條件下產(chǎn)生丙二醛（malondialdehyde，MDA），繪制 MDA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光值為橫坐標(biāo)，MDA含量（nmoL）為縱坐標(biāo)。MDA 含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=9.3905X-0.0024，R2=0.998。

1.2.2.2 肝線粒體的制備

采用差速離心法[15]制備肝線粒體，取新鮮鼠肝，用預(yù)冷的生理鹽水洗去血跡，放入線粒體分離介質(zhì)中，用電動(dòng)勻漿機(jī)將其冰浴勻漿。將勻漿液4 ℃ 3000 r/min離心10 min，取其上清液，10000 r/min離心10 min，沉淀即為線粒體，加入一定量分離介質(zhì)，制成懸液放入4 ℃冰箱備用。采用考馬斯亮藍(lán)法[16]測(cè)定線粒體蛋白含量。

1.2.2.3 肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分為空白、對(duì)照與SJP組，SJP組體系中加入6 mmoL/L Vit C、5 mmoL/L FeSO4、SJP、線粒體與0.1 moL/L PBS（對(duì)照不加SJP，空白不加Vit C、FeSO4、SJP），37 ℃水浴 1 h，加入 20%三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA），5000 r/min離心10 min，取2 mL上清，加入0.67% TBA 1 mL，沸水浴10 min，用PBS溶液調(diào)零，測(cè)定532 nm處吸光值。SJP的作用以MDA含量及抑制率（Inhibition Rate，IR）表示：

IR/%=(MDA含量對(duì)照-MDA含量SJP)/(MDA含量對(duì)照-MDA 含量空白)

1.2.3 還原力的測(cè)定

以 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）為陽(yáng)性對(duì)照。SJP組體系中加入PBS緩沖液(0.2 moL/L pH 6.6)、1%鐵氰化鉀、SJP與水（調(diào)零組不加BHT、SJP），50 ℃水浴20 min，加入100 g/L TCA 1.0 mL，5000 r/min離心2 min，取上清1.5 mL，加入FeCl3溶液（1 g/L）0.1 mL，用去離子水補(bǔ)至3 mL，混勻，測(cè)定700 nm處吸光值，吸光值越大即還原力越強(qiáng)[17]。

1.2.4 Fe2+螯合的測(cè)定

采用Xu等[18]方法測(cè)定，稍有改動(dòng)，以乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）為陽(yáng)性對(duì)照，SJP組體系中加入 SJP、FeSO4(0.375 mmoL/L)、Ferrozine (2.25 mmoL/L)與 Hepes（對(duì)照不加SJP），漩渦混勻，室溫靜置20 min，測(cè)定562 nm處吸光值。SJP的作用以螯合率表示[19]，按下式計(jì)算：

1.2.5 ·OH清除能力的測(cè)定

以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，SJP組體系中加入5 mmoL/L鄰二氮菲、0.2 moL/L PBS (pH 7.8)、7.5 mmoL/L FeSO4、SJP、1% H2O2（對(duì)照不加 SJP，空白對(duì)照不加SJP、1% H2O2），37 ℃水浴1 h，測(cè)定536 nm處Fe2+-鄰二氮菲復(fù)合物吸光值[20]。SJP的作用以清除率（Scavenging Rate，SR）表示，按下式計(jì)算：

1.2.6 H2O2清除能力的測(cè)定

以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，SJP組體系中加入SJP、0.1 mmoL/L H2O2、H2O、3%鉬酸銨、2 moL/L H2SO4、1.8 moL/L KI（對(duì)照不加SJP），參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[21]，靜置，采用滴定法在3 min時(shí)，用5 mmoL/L的硫代硫酸鈉溶液滴定至黃色消失為止，記錄硫代硫酸鈉溶液的消耗體積V。SJP的作用以SR表示，按下式計(jì)算：

1.2.7 O2·?清除能力的測(cè)定

采用 NBT法測(cè)定[22]，SJP組體系中加入 H2O、NBT（12.5 μL/mL）、SJP、NADH(60 μg/mL)、PMS(0.138 mg/mL)（對(duì)照不加SJP，空白不加PMS），漩渦混勻。使用空白調(diào)零，2 min時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定其于560 nm處吸光值。SJP的作用以SR表示，按下式計(jì)算：

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，運(yùn)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 SJP的多糖與蛋白質(zhì)含量

實(shí)驗(yàn)提取的刺參多糖為粗多糖，為了解其含量，測(cè)定粗多糖中的多糖與蛋白質(zhì)含量。經(jīng)計(jì)算得刺參粗多糖的多糖含量為33.21%，蛋白質(zhì)含量為5.30%。刺參多糖所含硫酸基高于其他海參，其糖鏈上有部分羥基發(fā)生硫酸酯化，且硫酸基含量占多糖的 30%左右[23]。硫酸苯酚法是根據(jù)多糖在硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物[24]。由于多糖中的糖殘基以結(jié)合形式存在，和單糖有所不同，在濃硫酸的作用下不能百分之百形成糠醛[25]。因而實(shí)驗(yàn)只能測(cè)定出硫酸脂基類多糖中的多糖含量，考慮到硫酸基的影響，故實(shí)際SJP多糖含量大約為63%左右。

2.2 SJP對(duì)線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

脂質(zhì)過(guò)氧化是一種氧化變質(zhì)反應(yīng)，脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程所產(chǎn)生的自由基與一些小分子產(chǎn)物，可引起多種細(xì)胞功能的損傷，如改變細(xì)胞膜滲透性與流動(dòng)性，對(duì)蛋白質(zhì)和DNA也有傷害（引起各種堿基損傷、DNA鏈斷裂和各種熒光產(chǎn)物生成，并對(duì)DNA分子鳥(niǎo)嘌呤堿基具有選擇性損傷[26]），并與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系[27]。故抑制脂質(zhì)氧化作用變得十分重要。

表1 SJP對(duì)線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響（±s，n=6）Table 1 Effects of SJP on the lipid peroxidation of mitochondria(±s, n = 6)

表1 SJP對(duì)線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響（±s，n=6）Table 1 Effects of SJP on the lipid peroxidation of mitochondria(±s, n = 6)

注：與對(duì)照組比較，“*”表示有顯著差異（p＜0.05），“**”表示有較顯著差異（p＜0.01），下表同。

組別 質(zhì)量濃度/(mg/mL) MDA/nmoL IR/%空白 0.30±0.082**對(duì)照 2.59±0.486 SJP 0.003 1.92±0.073** 27.80±2.65 0.007 1.75±0.063** 34.97±2.34 0.013 1.65±0.073** 40.98±3.12 0.027 1.56±0.082** 46.24±3.15

由結(jié)果可知，隨SJP質(zhì)量濃度升高，MDA值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明SJP在此濃度范圍內(nèi)可減少M(fèi)DA的生成，可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。脂質(zhì)過(guò)氧化與某些疾病的病理過(guò)程，如腫瘤、化學(xué)中毒、感染、炎癥、自身免疫疾病和心腦血管疾病等，以及衰老等生理過(guò)程均有密切聯(lián)系[28]。所以，SJP可能通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化而具有一定的抗衰老作用。

2.3 SJP對(duì)還原力的影響

表2 SJP對(duì)還原力的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of SJP on the reducing power (±s, n = 6)

表2 SJP對(duì)還原力的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of SJP on the reducing power (±s, n = 6)

注：組間不同字母表示有顯著差異（p＜0.05）。

組別 質(zhì)量濃度/(mg/mL) A700 BHT 0.002 0.13±0.013 a 0.003 0.22±0.011 b 0.017 0.81±0.049 c 0.033 1.22±0.086 d SJP 0.033 0.01±0.003 e 0.067 0.03±0.006 e 0.333 0.17±0.002 f 0.667 0.28±0.013 g

氧化還原反應(yīng)中給出電子而自身發(fā)生氧化的能力稱為還原力，它是物質(zhì)抗氧化的重要表現(xiàn)。采用普魯士藍(lán)法測(cè)定物質(zhì)的還原能力，反映其抗氧化能力。吸光值越大表示樣品還原力越強(qiáng)，抗氧化能力亦越強(qiáng)[29]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨SJP質(zhì)量濃度增加，吸光值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，還原力隨吸光值增加而增強(qiáng)，且其還原力與劑量之間呈正相關(guān)。

2.4 SJP對(duì)Fe2+螯合力的影響

表3 SJP對(duì)Fe2+螯合力的影響Table 3 Effects of SJP on the Fe2+ chelation

Fe2+螯合力測(cè)定是在 Fenton反應(yīng)（H2O2與 Fe2+的反應(yīng)生成·OH）之前，具有螯合 Fe2+活性的藥物降低過(guò)渡金屬酶（可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化）濃度，減少ROS的產(chǎn)生并減弱由此引起的氧化損傷[30]，故在抗氧化性測(cè)定中顯得很重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨SJP質(zhì)量濃度增加，對(duì)Fe2+的螯合能力隨之增強(qiáng)。當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.333 mg/mL時(shí)，螯合率可達(dá)到31.55%。但螯合作用遠(yuǎn)不如EDTA強(qiáng)。

2.5 SJP對(duì)·OH清除能力的影響

表4 SJP對(duì)·OH清除能力的影響Table 4 Effects of SJP on the scavenging ability of ·OH

體內(nèi)·OH主要由過(guò)氧化物負(fù)離子與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成?！H是一種體內(nèi)破壞生物分子最強(qiáng)的活性氧。實(shí)驗(yàn)采用鐵-鄰二氮菲法測(cè)定SJP對(duì)·OH的清除能力。通過(guò)Fenton反應(yīng)（H2O2/Fe2+體系）產(chǎn)生·OH，將鄰二氮菲-Fe2+溶液氧化成鄰二氮菲-Fe3+溶液。用鄰二氮菲-Fe2+（橙紅色）的褪色程度來(lái)表示·OH的清除程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BHT組與SJP組的吸光值在空白與對(duì)照組的范圍內(nèi)且呈上升趨勢(shì)，表明二者均有作用。隨 SJP質(zhì)量濃度增加，清除率也隨之增強(qiáng)。與 BHT組相比，可看出高濃度的SJP對(duì)·OH具有明顯的清除作用?！H與衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬等有關(guān)，·OH清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)。

2.6 SJP對(duì)H2O2清除能力的影響

H2O2是由兩個(gè)電子還原O2生成的，在O2和過(guò)渡金屬離子存在的情況下，H2O2可通過(guò) Fenton反應(yīng)生成·OH。由下表可知，隨著SJP質(zhì)量濃度逐漸增大，清除率越大，對(duì) H2O2的清除能力越強(qiáng)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，可看出SJP具有清除H2O2的能力。在人體內(nèi)，許多生物膜（如細(xì)胞線粒體膜）以及胞漿中均會(huì)產(chǎn)生H2O2，因細(xì)胞中許多細(xì)胞器均含生物膜結(jié)構(gòu)，故生物膜的過(guò)氧化病變對(duì)健康的影響可想而知[31]。

2.7 SJP對(duì)O2·?清除能力的影響

表6 SJP對(duì)O2·?清除能力的影響Table 6 Effects of SJP on the scavenging ability of O

表6 SJP對(duì)O2·?清除能力的影響Table 6 Effects of SJP on the scavenging ability of O

組別 質(zhì)量濃度/(mg/mL) A560 SR/%對(duì)照組 0.47±0.028 SJP 0.033 0.26±0.016 ** 44.81±3.45 0.067 0.15±0.009 ** 64.48±2.02 0.133 0.07±0.013 ** 82.62±0.98 0.267 0.05±0.009 ** 87.81±1.85

體內(nèi) O不發(fā)生化學(xué)變化時(shí)對(duì)人體無(wú)害，但與·OH結(jié)合后的產(chǎn)物可損壞細(xì)胞DNA，破壞人類機(jī)體功能。生物體內(nèi)O能長(zhǎng)時(shí)間地攻擊靶向目標(biāo)，且對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，它與人體的衰老息息相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨SJP質(zhì)量濃度增加，清除率隨之增加，說(shuō)明SJP具有清除的作用。

3 結(jié)論

3.1 海參廣泛分布于世界各海洋中。我國(guó)南海沿岸種類較多，約有20余種海參可供食用，其中以刺參的質(zhì)量為最佳[32]。海參粗多糖是從海參中提取的海洋生物制劑，含多糖和多肽，在醫(yī)藥領(lǐng)域有巨大應(yīng)用潛力，具降血脂、抗腫瘤、降血糖、抗病毒、體內(nèi)外抗氧化及清除ROS等作用。ROS是機(jī)體內(nèi)最常見(jiàn)也是最重要的自由基，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和保持機(jī)體功能上起很大作用。由于帶有不成對(duì)電子，極易發(fā)生得電子或失電子的反應(yīng)，一旦生成又會(huì)引發(fā)其他物質(zhì)生成自由基，由此引發(fā)連鎖反應(yīng)。過(guò)高的ROS水平會(huì)對(duì)細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損傷，ROS和許多疾病都有著密切的關(guān)系，近年來(lái)對(duì)ROS的研究已成為現(xiàn)代生命科學(xué)的熱點(diǎn)[33]。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SJP對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化有抑制作用，具有還原力和 Fe2+螯合能力，對(duì)·OH、H2O2、O2·?也具有一定的清除作用。大部分ROS作為呼吸鏈正常能量生成的副產(chǎn)物，在線粒體產(chǎn)生。線粒體主要通過(guò)調(diào)整 ROS的生成以及能量代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)其生理功能[34]；惡性細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)和功能與正常細(xì)胞中的不同，癌細(xì)胞中的線粒體過(guò)量產(chǎn)生ROS，通過(guò)其誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定、修飾基因表達(dá)與參與信號(hào)通路來(lái)誘使癌癥的發(fā)展[35]，因此保護(hù)線粒體具有重要意義。

3.3 線粒體功能障礙（ATP合成減少、活性氧增多、Ca2+紊亂和細(xì)胞凋亡等特征[36]）導(dǎo)致細(xì)胞功能被破壞，引起心血管與神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病，而這些疾病正是當(dāng)今損害人類健康的重大疾病，線粒體已成為研究與治療疾病的新方向。而SJP可通過(guò)抑制線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化與清除ROS來(lái)保護(hù)線粒體，為相關(guān)疾病的治療、新藥研發(fā)以及功能性食品開(kāi)發(fā)提供了新思路。

[1]王平遠(yuǎn),高麗,許豪文.運(yùn)動(dòng)及衰老過(guò)程中線粒體 ROS機(jī)制的探討[J].山東體育學(xué)院學(xué)報(bào),2003,19(2):36-39 WANG Ping-yuan, GAO Li, XU Hao-wen. Approachment of ROS in the mitochondria during exercise and aging [J].Journal of Shandong Physical Education Institute, 2003, 19(2): 36-39

[2]李興太,張春英,仲偉利,等.活性氧的生成與健康和疾病關(guān)系研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2016,37(13):257-270 LI Xing-tai, ZHANG Chun-ying, ZHONG Wei-li, et al.Advances in generation of reactive oxygen species associated with health and diseases [J]. Food Science, 2016, 37(13):257-270

[3]SOHAL R S, SOHAL B H. Hydroge peroxide release by mitochondria increases during aging [J]. Mechanisms of Ageing and Development, 1991, 57(2): 187-202

[4]Shigenaga M K, Hagen T M, Ames B N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91(23): 10771-10778

[5]李興太,紀(jì)瑩.線粒體氧化應(yīng)激與天然抗氧化劑研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2015,36(7):268-277 LI Xing-tai, JI Ying. Recent advances in mitochondrial oxidative stress and natural antioxidants [J]. Food Science,2015, 36(7): 268-277

[6]韓秋菊,馬宏飛.海參多糖的提取與純化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(14):8071-8072,8074 HAN Qiu-ju, MA Hong-fei. Extraction and purification of polysaccharides in sea cucumber [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2012, 40(14): 8071-8072, 8074

[7]盛卸晃.刺參多糖對(duì)神經(jīng)細(xì)胞作用的研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2012 SHENG Xie-huang. Study of the effect of sulfated polysaccharide purified feom the sea cucmberstichopus iaponicuson neural cells [D]. Jinan: Shandong University,2012

[8]張祺,李學(xué)敏,李兆杰,等.海參巖藻聚糖硫酸酯對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及信號(hào)通路研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2015,31(1):87-92 ZHANG Qi, LI Xue-min, LI Zhao-jie, et al.Immunomodulatory effects of sea cucumber fucoidan on macrophage and the signaling pathways [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2015, 31(1): 87-92

[9]BERTEAU O, MULLOY B. Sulfated fucans fresh perspectives structures functions and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active towards this class of polysaccharide [J]. Glycobiology, 2003, 13(6):29-40

[10]LUO L, WU M, XU L, et al. Comparison of physicochemical characteristics and anticoagulant activities of polysaccharides from three sea cucumbers [J]. Marine Drugs, 2013, 11(2):399-417

[11]李學(xué)鵬,王祺,勵(lì)建榮,等.海參酶解液的體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(24):100-103 LI Xue-peng, WANG Qi, LI Jian-rong, et al. Study on the antioxidant activity of sea cucumber (Stichopus japonicus)enzymatic hydrolysatein vitro[J]. Science and Technology of Food Industry, 2014, 35(24): 100-103

[12]許靜,解秋菊.海參臟器多糖體外抗氧化活性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2011,32(12):29-31 XU Jing, XIE Qiu-ju. Study on antioxidant activity of polysaccharide fromHolothurian Harsletin Vitro[J]. Food Research and Development, 2011, 32(12): 29-31

[13]Dubois M, Gilles K A, Hamilton J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances [J].Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356

[14]Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction [J]. Analytical Biochemistry, 1979, 95(2): 351-358

[15]Michele A S, Jhon Z, Alain Y F, et al. Ischemic injury to rat forebrain mitochondria and cellular calcium homestasis [J].Biochimica Et Biophysica(BBA)-Molecular Cell Research,1992, 1134(3): 223-232

[16]楊靜,白冰,王寧,等.考馬斯亮藍(lán)法對(duì)煙草薄片涂布液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,56(5):946-947,950 YANG Jing, BAI Bing, WANG Ning, et al. Determination of protein content in reconstituted tobacco coating liquid by coomassie brilliant blue method [J]. Hubei Agricultural Sciences, 2017, 56(5): 946-947, 950

[17]ZHAO J, LIU T, MA L, et al. Antioxidant and preventive effects fromNymphaea candidaflower onin vitroimmunological liver injury of rat primary hepatocyte cultures[J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2011, 497673: 1-8

[18]XU X M, CAO R Y, HE L, et al. Antioxidant activity of hydrolysates derived from porcine plasma [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89(11): 1897-1903

[19]Mandal S, Hazra B, Srakar R, et al. Assessment of the antioxidant and reactive oxygen species scavenging activity of methanolic extract of Caesalpinia crista leaf [J].Evidence-based Complementary and Alternative Medicine,2011, 173768: 1-11

[20]LIN Z, ZHU D, YAN Y, et al. An antioxidant phyto-therapy to rescue neuronal oxidative stress [J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2011, 519517: 1-7[21]Zhao G R, Xiang Z J, Ye T X, et al. Antioxidant activities ofSalvia miltiorrhizaandPanax notoginseng[J]. Food Chemistry, 2006, 99(4): 767-774

[22]Fontana M, Mosca L, Rosei M A. Interaction of enkephalines with oxyradicals [J]. Biochemical Pharmacology, 2001,61(10): 1253-1257

[23]李春艷,常亞青.海參的營(yíng)養(yǎng)成分介紹[J].科學(xué)養(yǎng)魚(yú),2006,2:71-72 LI Chun-yan, CHANG Ya-qing. Introduction of nutritional components of sea cucumber [J]. Scientific Fish Farming,2006, 2: 71-72

[24]羅毅,潘細(xì)貴,劉剛,等.苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量顯色方式的優(yōu)選[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2005,12(1):45-46 LUO Yi, PAN Xi-gui, LIU Gang, et al. Optimization of the way of coloration in the processof determining polysaccharide content by phenol-sulfuric acid method [J].Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine, 2005, 12(1): 45-46

[25]楊勇杰,姜瑞芝,陳英紅,等.苯酚硫酸法測(cè)定雜多糖含量的研究[J].中成藥,2005,27(6):706-708 YANG Yong-jie, JIANG Rui-zhi, CHEN Ying-hong, et al.Determination of sugers in heteropolysaccharide by phenol-sulfuric acid method [J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2005, 27(6): 706-708

[26]劉曉麒,曹恩華.脂質(zhì)過(guò)氧化引起的DNA損傷研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1994,21(3):218-222,281-282 LIU Xiao-qi, CAO En-hua. DNA damage induced by lipid peroxidation [J]. Progress in Biochemistry and Biophysics,1994, 21(3): 218-222, 281-282

[27]HALLIWELL B. Vitamin C and genomic stability [J].Mutation Research/fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2001, 475(1): 29-35

[28]HORTON A A. Lipid peroxidation and mechanisms of toxicity [J]. Critical Reviews in Toxicology, 1987, 18(1): 27-29

[29]張德華,鄧輝,喬德亮.植物多糖抗氧化體外實(shí)驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2015,27(4):747-751 ZHANG De-hua, DENG Hui, QIAO De-liang. Research progress on experimental methods on testingin vitroantioxidant activity of plant polysaccharides [J]. Natural Product Research and Development, 2015, 27(4): 747-751

[30]韋豪華,張紅玲,李興太.芪參補(bǔ)氣藥茶保護(hù)線粒體及其機(jī)制[J].大連民族大學(xué)學(xué)報(bào),2017,19(3):216-221 WEI Hao-hua, ZHANG Hong-ling, LI Xing-tai.Mitochondrial protection of Astragalus membranaceus/Codonopsis pilosula Qi-invigorating herbal tea and its underlying mechanism [J]. Journal of Dalian Minzu University, 2017, 19(3): 216-221

[31]趙保路.自由基、營(yíng)養(yǎng)、天然抗氧化劑與衰老[J].生物物理學(xué)報(bào),2010,26(1):26-36 ZHAO Bao-lu. Free radicals, nutrition, natural antioxidant and aging [J]. Acta Biophysicas Sinica, 2010, 26(1): 26-36

[32]展學(xué)孔,周海妹,馬小花,等.海參多糖提取新工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(15):40-42 ZHAN Xue-kong, ZHOU Hai-mei, MA Xiao-hua, et al. New extraction technology of polysaccharide from sea cucumber[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2011, 17(15): 40-42

[33]敖純.蟲(chóng)茶醇提取物對(duì)超氧陰離子和羥基自由基的清除作用[J].肉類研究,2010,4:60-64 AO Chun. Scavenging effects of sandy-tea ethanol extract on super oxide anion and hydroxyl radical [J]. Meat Research,2010, 4: 60-64

[34]Fernandes M A, Marques R J, Vicente J A, et al. Sildenafil citrate concentrations not affecting oxidative phosphorylation depress H2O2generation by rat heart mitochondria [J].Molecular and Cellular Biochemistry, 2008, 309(1): 77-85

[35]Yang Y, Karakhanova S, Hartwig W, et al. Mitochondria and mitochondrial ROS in cancer: novel targets for anticancer therapy [J]. Journal of Cellular Physiology, 2016, 231(12):2570-2581

[36]熊燕,張梅,陳菲,等.線粒體功能障礙與心血管疾病[J].中國(guó)病理生理雜志,2013,29(2):364-370 XIONG Yan, ZHANG Mei, CHEN Fei, et al. Roles of mitochondrial dysfunction in cardiovascular diseases [J].Chinese Journal of Pathophysiology, 2013, 29(2): 364-370