LC-ICP-MS法研究蓮藕中砷的形態(tài)分布

張靜玉，牟濤，王寧，矯繼峰，趙金香，潘懿

（營口理工學(xué)院化學(xué)與材料工程系，遼寧營口 115000）

蓮藕是一種常見的水生蔬菜，可食部分主要是地下莖，旺盛生長(zhǎng)期細(xì)嫩的稱藕帶，結(jié)藕期地下莖前端膨大結(jié)為藕，葉俗稱荷葉，果實(shí)為蓮肉或蓮子，均有很高的營養(yǎng)價(jià)值，食用廣泛。作為可替代蟹田養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)型種植品種目前已引入北方地區(qū)，既豐富了北方的蔬菜市場(chǎng)，又有較高的經(jīng)濟(jì)效益。

有研究表明水生植物對(duì)砷的富集作用明顯，其總砷含量往往高于陸生植物。國標(biāo)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量GB 2762-2017中規(guī)定，新鮮蔬菜中總砷的含量不高于0.5 mg/kg。但水生蔬菜受水質(zhì)等環(huán)境變化影響較大，而水質(zhì)污染的波動(dòng)性明顯高于土壤，超標(biāo)現(xiàn)象明顯偶有發(fā)生[1]。由于不同形態(tài)的砷毒性差別很大[2]，毒性較大的主要是無機(jī)態(tài)的亞砷酸鹽As(Ⅲ)和砷酸鹽As(Ⅴ)，而有機(jī)態(tài)的一甲基砷MMA、二甲基砷DMA毒性較低，砷甜菜堿AsB和砷膽堿AsC基本是無毒的。因此我國部分農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水生蔬菜中無機(jī)砷的衛(wèi)生指標(biāo)[3]。許曉光[4]和王方園[5]等分別對(duì)水生蔬菜中鉛、鎘、砷和汞等重金屬元素總量的遷移富集規(guī)律開展了研究，植物中砷形態(tài)分析的研究報(bào)道也有很多[6,7]，但對(duì)整個(gè)植株不同器官中元素形態(tài)的分布和富集規(guī)律尚未見報(bào)道。

砷形態(tài)分析方法主要有液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用（LC-AFS）法[6]和液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（LC-ICP-MS）法[7]，其中LC-ICP-MS法分析的砷形態(tài)種類比較豐富，是目前常用的分析方法。

本文采用優(yōu)化的超聲酸提取方法，LC-ICP-MS聯(lián)用法測(cè)定蓮藕不同部位的砷形態(tài)，通過比對(duì)不同砷濃度環(huán)境、不同生長(zhǎng)階段砷的形態(tài)數(shù)量變化，分析砷的分布和轉(zhuǎn)化規(guī)律，為蓮藕乃至其他水生蔬菜的生態(tài)環(huán)境監(jiān)控及食品安全風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

總砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW08611（1000 μg/mL）和砷形態(tài)溶液 As(Ⅲ) GBW08666、As(Ⅴ) GBW08667、MMA GBW08668、DMA GBW08669、AsB GBW08670（75.7±1.2 μg/g、17.5±0.4 μg/g、25.1±0.8 μg/g、52.9±1.8μg/g、38.8±1.1 μg/g），中國計(jì)量科學(xué)研究院；硝酸、鹽酸、高氯酸、硫酸均為優(yōu)級(jí)純（國藥集團(tuán)），硼氫化鉀、氫氧化鉀、磷酸二氫銨、氨水均為分析純（國藥集團(tuán)）。乙醇為色譜純（國藥集團(tuán)）。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的制備用水全部用 Milli-Q超純水（電阻率＞18 MΩ·cm）?？偵樵貥?biāo)準(zhǔn)溶液用2%硝酸逐級(jí)稀釋后，配制成濃度分別為0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的總砷標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成各砷形態(tài)濃度分別為0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100液相色譜儀、Agilent7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜儀及聯(lián)用配件，美國安捷倫公司；PRP-X100陰離子色譜柱（10 μm，4.1×250 mm），瑞士漢米爾頓公司；AFS-2202雙道氫化物發(fā)生原子熒光光譜儀，北京海光公司；KQ3200數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；CT14RD高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器有限公司；AE-240電子天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高、低濃度砷栽培環(huán)境模擬建立

采集藕田栽培試驗(yàn)田土壤（pH 7.22，總砷含量4.65 mg/kg）和水體（pH 6.98，總砷含量0.035 mg/L）作為空白基體，并適當(dāng)施肥，以相同配比放于2只培育箱中，分別編號(hào)為A和B。配制高濃度砷鹽溶液，投入到B培育箱中，攪拌均勻后放置數(shù)日，使土壤和水體對(duì)砷的吸附達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。

1.3.2 植物栽培

選取長(zhǎng)勢(shì)良好、大小均勻的鄂蓮子藕種苗，在 5月15日分別移植于2個(gè)培育箱中，每箱3支，相同條件下常規(guī)培育管理，注意水位的保持。在蓮藕旺盛生長(zhǎng)期8月15日和蓮藕結(jié)藕期10月15日分別采摘每只蓮藕的不同部位根、藕帶、藕、葉和蓮蓬，將箱中各支蓮藕的相同部位作為一個(gè)樣品，以增強(qiáng)樣品的均勻性和代表性，清洗后經(jīng)組織勻漿機(jī)粉成糊狀，低溫保存，盡快測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

質(zhì)譜條件：等離子氣流量16 L/min；載氣流量1.02 L/min；補(bǔ)償氣流量0.2 L/min；RF功率1550 W；采樣深度 8.0 mm；霧化室溫度 2 ℃；輔助氣流量 0.9 L/min；氧化物比率1.21%；雙電荷比率0.95%；四極桿真空度0.0001 Pa；QP偏轉(zhuǎn)電壓-2.8 V；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.3 r/s；調(diào)諧模式No Gas，監(jiān)測(cè)元素75As。

液相色譜條件：流動(dòng)相25 mmol/L NH4H2PO4溶液（氨水調(diào)至pH 8.0）：等度洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫為室溫。

原子熒光條件：原子化器高度8 mm，載氣流速400 mL/min；屏蔽氣流速800 mL/min；砷燈電流60 mA，輔助燈電流30 mA；負(fù)高壓300 V。

1.3.4 蓮藕各器官總砷含量測(cè)定

稱取樣品0.5 g于100 mL燒杯中，加入10 mL HNO3、1 mL HClO4和1 mL H2SO4，加蓋表面皿后靜置過夜。于電熱板300 ℃加熱，若消解液顏色變深，可適當(dāng)補(bǔ)加HNO3直至消解液為無色或淡黃色，繼續(xù)加熱至HClO4白煙散盡，H2SO4白煙開始冒出時(shí)停止加熱。冷卻后加水10 mL再加熱至冒出白煙。冷卻后用水轉(zhuǎn)移至 50 mL容量瓶中，加入 10 mL HCl、5 mL5%抗壞血酸和5 mL5%硫脲，用水定容搖勻。同時(shí)做試劑空白。采用原子熒光光譜儀在設(shè)定條件下測(cè)定。

1.3.5 蓮藕各器官砷形態(tài)含量測(cè)定

稱取樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入20 mL 1%HNO3溶液作為提取試劑，于75 ℃水浴、60%超聲功率條件下提取40 min后，取出冷卻至室溫，配重后于高速冷凍離心機(jī)以轉(zhuǎn)速8000 r/min在4 ℃離心15 min，取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜。同時(shí)做試劑空白。采用LC-ICP-MS在設(shè)定的液相色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)下列公式計(jì)算蓮藕各器官中總砷和砷形態(tài)的含量：

式中：w為蓮藕中砷元素的含量(mg/kg)；C為待測(cè)溶液中砷元素的質(zhì)量濃度(μg/L)；C0為空白溶液中砷元素的質(zhì)量濃度(μg/L)；V為待測(cè)溶液的體積(mL)；f為待測(cè)溶液的稀釋倍數(shù)；m為稱量蓮藕的質(zhì)量(g)。

所得數(shù)據(jù)為平行測(cè)定3次的平均值，同時(shí)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 砷形態(tài)提取條件優(yōu)化

參考國標(biāo) GB 5009.11-2014[8]中無機(jī)砷的分析方法，采用1% HNO3溶液作為提取試劑。但標(biāo)準(zhǔn)中熱提取方法提取時(shí)間較長(zhǎng)，且高溫對(duì)砷形態(tài)的穩(wěn)定性影響較大，因此對(duì)提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，采用超聲提取法。

2.1.1 提取溫度選擇

分別設(shè)定提取溫度為 50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，比較樣品提取的砷形態(tài)含量，70 ℃和80 ℃時(shí)砷形態(tài)可全部提取。為避免較高溫度導(dǎo)致砷形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化，選擇70 ℃作為提取溫度。

2.1.2 提取時(shí)間選擇

分別測(cè)定樣品在超聲時(shí)長(zhǎng)為20 min、40 min和60?min提取的砷形態(tài)含量，結(jié)果表明，超聲40 min和60 min提取效率基本一致，因此選擇較短的提取時(shí)間，縮短實(shí)驗(yàn)周期。

2.1.3 提取功率選擇

分別在 20%、40%、60%、80%功率下進(jìn)行超聲提取，除20%提取效率略低外，其他功率沒有明顯差別，考慮到能源和穩(wěn)定性因素，因此選擇中間值60%作為提取功率。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

國標(biāo)方法[8]的流動(dòng)相不適用于陰離子交換色譜柱PRP X-100，選擇25 mmol/L磷酸二氫銨溶液（pH 8.0）作為流動(dòng)相，8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，各成分保留時(shí)間見表1，5種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

圖1 5種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（80 μg/L）Fig.1 Chromatogram of five mixed standard arsenic species (80μg/L)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和精密度

各砷形態(tài)及總砷在0～100 μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和精密度結(jié)果見表1。

表1 各砷形態(tài)線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和精密度（n=6）Table 1 Linear equations, correlation coefficients, detection limits and precisions of arsenic species (n=6)

2.4 提取形態(tài)穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率

在A箱根須樣品中加入40 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，平行進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，考察提取過程中砷形態(tài)是否發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。結(jié)果見表2。

由結(jié)果可知，在超聲提取的條件下，各砷形態(tài)基本保持不變，相互轉(zhuǎn)化不明顯。

2.5 蓮藕中總砷及砷形態(tài)分布

用本方法分析不同栽培砷環(huán)境、不同生長(zhǎng)時(shí)期采集的蓮藕不同器官中的總砷含量和各砷形態(tài)含量，分析結(jié)果見表3，砷形態(tài)色譜圖見圖2。

表2 砷形態(tài)的加標(biāo)回收率Table 2 Spiked recoveries of arsenic species

表3 蓮藕不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同部位中砷形態(tài)和總量的測(cè)定結(jié)果及無機(jī)砷比率Table 3 Results of arsenic species and total arsenic and the ratios of inorganic arsenic in different parts of lotus at different growth periods

圖2 高砷環(huán)境栽培的蓮藕結(jié)藕期不同部位的砷形態(tài)色譜圖Fig.2 Chromatograms of arsenic species in different parts of lotus grew in high arsenic environment

各砷形態(tài)之和與總砷的比值即回收率為90.63%～104.85%，由結(jié)果可知，蓮藕中各砷形態(tài)均被檢出。在低砷模擬環(huán)境下（A箱）種植的蓮藕，總砷及各砷形態(tài)含量都很低，無機(jī)砷以As(Ⅲ)為主，有機(jī)砷主要為AsB和MMA。而在高砷模擬環(huán)境下（B箱）種植的蓮藕，總砷和各砷形態(tài)含量都很高，除了蓮蓬總砷略低，其余各器官都超出了國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)限量要求。蓮藕對(duì)環(huán)境中的砷的富集作用非常明顯。嚴(yán)格控制蓮藕種植的生態(tài)環(huán)境，是控制蓮藕食品安全的重要環(huán)節(jié)。高砷環(huán)境蓮藕中砷形態(tài)比低砷環(huán)境下增加了DMA和As(Ⅴ)兩種形態(tài)，可能是在植株內(nèi)富集的高濃度砷，受甲基化程度變高、轉(zhuǎn)化率改變等影響造成的。

由不同生長(zhǎng)時(shí)期蓮藕各部位總砷含量可知，在旺盛生長(zhǎng)期，蓮藕對(duì)砷的富集能力比較強(qiáng)，并從根部向其他各器官轉(zhuǎn)移，總砷含量須根＞藕帶＞葉；在結(jié)藕期，各器官總砷含量相對(duì)增加，但增加量不如旺盛生長(zhǎng)期明顯，可能與該階段主要為蓮藕內(nèi)部營養(yǎng)成分的遷移，從外界吸收活躍度降低有關(guān)。低砷環(huán)境栽培的蓮藕總砷含量順序依次為須根＞藕帶＞葉＞藕＞蓮蓬，而高砷環(huán)境中總砷含量順序?yàn)榕簬В卷毟九海救~＞蓮蓬，藕與葉的含量水平基本相似。推測(cè)蓮藕富集砷濃度過高時(shí)，須根對(duì)砷的耐受和儲(chǔ)藏能力有限，向地上轉(zhuǎn)移趨勢(shì)更加明顯，砷更多的富集于地下莖中。藕雖然和藕帶同為地下莖，但藕在酶的作用下，根狀莖前端膨大變粗，形成主藕和子藕，干物質(zhì)、淀粉、總糖等迅速向藕轉(zhuǎn)運(yùn)，總砷遷移量低于營養(yǎng)成分遷移量，藕的總砷含量降低，低于藕帶。

由不同生長(zhǎng)時(shí)期蓮藕各部位的砷形態(tài)分布可知，在旺盛生長(zhǎng)期，蓮藕各器官無機(jī)砷比率普遍高于結(jié)藕期，推測(cè)由于該階段植株從環(huán)境中吸收水和營養(yǎng)成分，對(duì)砷的富集效率高于砷的轉(zhuǎn)化效率，而環(huán)境中添加的砷主要以無機(jī)砷的形態(tài)存在，因此各器官中無機(jī)砷比率較高；而結(jié)藕期，從環(huán)境中富集砷的水平下降，同時(shí)砷與細(xì)胞的結(jié)合受到植株內(nèi)淀粉、多糖和蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)化的影響[9]，發(fā)生甲基化等去毒反應(yīng)效率增加，以有機(jī)態(tài)形式存在，無機(jī)砷比率降低。不同生長(zhǎng)階段、不同砷栽培環(huán)境條件下，地下部分的無機(jī)砷比率均高于地上部分，可能與砷在遷移轉(zhuǎn)化過程中與器官組織結(jié)合轉(zhuǎn)化成有機(jī)態(tài)儲(chǔ)存在細(xì)胞中有關(guān)[10]，而在須根中主要以吸附砷為主，轉(zhuǎn)化能力有限。藕中無機(jī)砷比率明顯低于地上部分的葉和同為地下莖的藕帶，僅略高于蓮蓬，可能也與結(jié)藕過程中酶的相互作用有關(guān)。蓮藕的這一特性，從食品安全角度考慮是非常有利的。

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了超聲提取-LC-ICP-MS法測(cè)定蓮藕中五種砷形態(tài)的分析方法，優(yōu)化了提取條件和色譜條件，并對(duì)方法進(jìn)行了方法學(xué)考證。結(jié)果表明，提取速度快，各形態(tài)穩(wěn)定，回收率高，方法簡(jiǎn)便、快速，8 min中內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，可廣泛應(yīng)用于其他植物樣品中砷形態(tài)的分析。該方法研究了蓮藕在不同砷濃度栽培環(huán)境下、不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同器官中總砷和砷形態(tài)的分布，蓮藕對(duì)砷有較高的富集作用，各器官無機(jī)砷比率在29.03%～45.21%之間。不同砷濃度環(huán)境下栽培的蓮藕砷的形態(tài)略有差異，低濃度砷環(huán)境下蓮藕中砷以As(Ⅲ)、AsB和MMA形式存在；高濃度砷環(huán)境下蓮藕中砷轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)的比率略低，無機(jī)砷以As(Ⅲ)和As(Ⅴ)形式同時(shí)存在，As(Ⅲ)比率明顯高于As(V)，有機(jī)態(tài)砷主要以AsB和MMA存在，部分器官含有少量的 DMA。蓮藕地下部分的總砷含量和無機(jī)砷比率普遍高于地上部分，向地上轉(zhuǎn)移砷能力有限，不屬于砷超富集植物。藕和蓮蓬作為蓮藕的可食部分，無機(jī)砷比率低于其他器官，更有利于食品安全控制。旺盛生長(zhǎng)期的藕帶對(duì)砷的富集水平較高，無機(jī)砷比率也略高于其他可食部分，需要更嚴(yán)格的質(zhì)量控制。

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