萃取有機(jī)物污染黃銅礦的At. thiooxidans菌浸出

余華龍，劉曉榮，申君輝，池道杰

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萃取有機(jī)物污染黃銅礦的At. thiooxidans菌浸出

余華龍1，劉曉榮1，申君輝1，池道杰2

(1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201418；2. 東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620)

銅萃取有機(jī)物對浸礦微生物的危害日益受關(guān)注，探討了()菌在被銅萃取有機(jī)物污染的低品位黃銅礦表面的吸附行為及其生物浸出特征。結(jié)果表明：由于萃取有機(jī)物的吸附增強(qiáng)了礦石表面疏水性與電負(fù)性，使細(xì)胞在受污染低品位黃銅礦表面的吸附率提高19%。然而，高細(xì)胞吸附率并不意味著高浸出率。在受污染低品位黃銅礦的生物浸出過程中，細(xì)胞生長速度降低9%，銅浸出率降低29%。CLSM以及SEM觀察發(fā)現(xiàn)，在萃取有機(jī)物脅迫下，附著細(xì)胞的胞外多聚物(Extracellular polymeric substances, EPS)分泌受到抑制，勢必影響生物膜的構(gòu)建。在礦石被污染的情況下，有機(jī)膜覆蓋、細(xì)胞新陳代謝受抑制、EPS分泌減少，是導(dǎo)致浸出率降低的主要原因。

嗜酸氧化硫硫桿菌；溶劑萃取；細(xì)胞吸附；胞外多聚物；黃銅礦

在生物浸出?萃取?電積提銅工藝中，萃取完成后，萃余液將返回生物浸出體系循環(huán)利用。但萃余液中包含了以夾帶、溶解等方式流失的萃取有機(jī)物。這些有機(jī)物對浸礦細(xì)菌的危害越來越受到關(guān)注[1?2]。研究者們[3?4]很早就發(fā)現(xiàn)LIX類萃取劑以及萃取劑中包含的煤油、正辛烷等成分對浸礦細(xì)菌生長具有抑制作用。同時(shí)，不同細(xì)菌對萃取有機(jī)物適應(yīng)程度不同，如和菌相對于和更容易受到抑制[5?6]。有研究學(xué)者指出這種抑制作用是某種化學(xué)?生物聯(lián)合作用機(jī)制[7]。近年來有研究表明[8]，銅萃取有機(jī)物會(huì)破壞浸礦細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞形貌縮短，胞內(nèi)空泡增加，繼而降低浸出效率。

目前，針對萃取有機(jī)物影響生物浸出過程的大部分研究僅關(guān)注有機(jī)物對細(xì)菌新陳代謝與浸出率的影響。然而，萃余液中流失的有機(jī)物進(jìn)入浸出體系，絕不是單方面抑制細(xì)菌的生長代謝和氧化浸出，勢必也會(huì)與被浸礦物發(fā)生作用，且可能先于細(xì)菌吸附到礦物表面。在生物浸出過程中，浸礦細(xì)菌在礦石表面的吸附是其與礦物深度作用的前提。吸附在礦物表面的細(xì)菌分泌胞外聚合物并形成生物膜，介導(dǎo)了細(xì)菌與礦物之間的物質(zhì)和能量傳遞，對有價(jià)金屬的浸出發(fā)揮重要作用[9?10]。萃取有機(jī)物如吸附到礦物表面必定會(huì)對細(xì)菌吸附及浸出產(chǎn)生影響，而從礦石被污染的角度考察萃取有機(jī)物對生物浸出過程的影響至今未見研究報(bào)道。為此，本文作者以菌為浸礦細(xì)菌，探討低品位黃銅礦被萃取有機(jī)物污染后，細(xì)菌在礦物表面的吸附行為以及受染礦物的生物浸出特征。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

本研究中所用的低品位黃銅礦來自于江西德興銅業(yè)集團(tuán)。高純度黃銅礦購自于奧地利國家自然博物館。幾種礦物化學(xué)成分如表1。

實(shí)驗(yàn)用萃取劑為LIX984N，由德國BASF上海分公司提供。稀釋劑為260號工業(yè)磺化煤油。

實(shí)驗(yàn)用嗜酸氧化硫硫桿菌(ATCC53993)，由德國杜伊斯堡?埃森大學(xué)生物膜中心提供。采用Mackintosh medium(MAC)培養(yǎng)基[11]((NH4)2SO40.132 g/L，CaCl2?2H2O 0.147 g/L，MgCl2? 6H2O 0.025 g/L，KH2PO40.027 g/L)，在接種之時(shí)于培養(yǎng)基中加入1 g滅菌后的單質(zhì)硫，調(diào)節(jié)其pH為2.0。MAC培養(yǎng)基在120 °C下壓力蒸汽滅菌20 min。以低品位黃銅礦為能源，在MAC培養(yǎng)基中對菌進(jìn)行多次傳代馴化，最后得到適應(yīng)在10%的礦漿濃度下生長良好的菌種。培養(yǎng)條件為在恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城ZHWY?2102型)中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。

表1 幾種礦物化學(xué)元素分析結(jié)果

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶劑萃取

萃取在自制的電動(dòng)攪拌槽中進(jìn)行，萃取有機(jī)相由一定濃度的LIX984N和260號工業(yè)磺化煤油混合而成。將MAC培養(yǎng)基與等體積萃取有機(jī)相攪拌混合10 min，攪拌速度400 r/min，分相完全后，取150 mL萃余液(即受污染的MAC培養(yǎng)基)于錐形瓶中，隨后加入礦石，在搖床中恒溫震蕩2 h，使得萃取有機(jī)物吸附到礦物表面，之后過濾并自然晾干48 h，得到浸出實(shí)驗(yàn)用的受染礦石樣品。

1.2.2 細(xì)胞吸附

采用顯微計(jì)數(shù)的方法研究細(xì)胞在礦石表面的吸附。取90 mL的純凈MAC培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，接入10 mL的細(xì)菌培養(yǎng)液，恒溫磁力攪拌10 min后，加入2 g黃銅礦。通過吸附前后溶液中懸浮細(xì)胞數(shù)的差值得到細(xì)菌在礦物表面的吸附量，其吸附率計(jì)算公式為

式中：i和n別為初始細(xì)菌濃度與時(shí)刻取樣檢測的濃度；e為吸附率。

1.2.3 低品位黃銅礦的生物浸出

將經(jīng)過馴化的菌種接種到含有10%受染礦樣的純凈MAC培養(yǎng)基中，于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩浸出。浸礦初期每隔6 h調(diào)節(jié)溶劑其pH為2.0，如在2.0以下則不用調(diào)節(jié)。用(雷磁PHS?3E型)精密pH測量儀測量浸出液pH和氧化還原電位。每隔2 d取樣分析過程參數(shù)，以同批次菌種浸出未被有機(jī)相污染的清潔低品位黃銅礦，每個(gè)條件做兩組平行試驗(yàn)。

1.3 性能表征

用英國馬爾文公司的Zeta-nanosize電位粒徑測定分析儀測定電位，以及美國KINO公司的Optical Contact Angle & interface tension meter進(jìn)行接觸角測量；Nicolet 380型智能傅立葉紅外光譜儀器(Thermo Fisher Scientific，美國)分析有機(jī)物的紅外光譜；北京譜析通用公司TAS 990 Super進(jìn)行銅離子濃度測定；FEI Quanta 200 FEG型的掃描電子顯微鏡和蔡司LSM 510激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察礦物以及細(xì)胞形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取有機(jī)物對礦石表面的污染

萃取劑LIX984N是由體積比1:1的LIX860N和LIX84組成，LIX860N的有效成分為5-壬基水楊醛肟，LIX84的有效成分為2-羥基-5-壬基苯乙酮肟。而260號工業(yè)磺化煤油中主要含有C11-C15的飽和烷烴以及少量稠環(huán)芳烴、硫醇、環(huán)氧烷烴等雜質(zhì)以及其他極性物質(zhì)[12?13]。當(dāng)?shù)推肺稽S銅礦接觸到萃余液中有機(jī)物時(shí)，兩者絕非相安無事，如圖1所示，低品位黃銅礦紅外圖譜發(fā)生了明顯變化，在1644.9 cm?1處和1250 cm?1處出現(xiàn)了分別屬于肟基C=N—和—C=O的伸縮振動(dòng)峰。在波長2980.4 cm?1和2901.7 cm?1處出現(xiàn)了C—H—的伸縮振動(dòng)峰，3450 cm?1處出現(xiàn)了OH—的伸縮振動(dòng)峰。這些峰的出現(xiàn)證明了萃取有機(jī)物在礦石表面的污染。

圖1 低品位黃銅礦受萃取有機(jī)物污染前后的紅外光譜

2.2 細(xì)胞在受污染礦石表面的吸附行為

圖2所示為在低品位黃銅礦表面受污染前后細(xì)胞的吸附特征。由圖2可見，菌細(xì)胞在最初5 min內(nèi)快速吸附到礦物表面，并很快趨于吸附平衡。在被萃取有機(jī)物污染的礦石表面，其初期吸附速度更快，平衡吸附率提高約19%，但吸附達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間延遲到7 min。SEM觀察表明，對比黃銅礦表面被有機(jī)物污染前后細(xì)胞吸附的形貌(分別見圖3(a)和圖3(b))，發(fā)現(xiàn)在受染黃銅礦表面吸附細(xì)胞更多且更密集。

圖2 At. thiooxidans細(xì)胞在低品位黃銅礦被污染前后的吸附率

2.3 受污染黃銅礦的生物浸出特征

被萃取有機(jī)物污染的低品位黃銅礦，與清潔低品位黃銅礦，在接種等量同批次菌液后進(jìn)行對比浸出，礦漿濃度保持為10%，接種量為6%，細(xì)胞初始濃度3.5×107mL?1。

如圖4(a)所示，受污染礦石生物浸出時(shí)，懸浮細(xì)胞濃度在初始階段出現(xiàn)一個(gè)明顯低谷，應(yīng)為細(xì)胞在有機(jī)物污染礦石表面吸附率增高所致，最大懸浮細(xì)胞濃度降低9%。最終浸出率降低29%(見圖4(d))。在浸出后期，受污染黃銅礦浸出體系中溶液pH更高、氧化還原電位更低(見圖4(b)和圖4(c))，都說明菌的活性降低，浸礦能力下降。

細(xì)菌在礦物表面的吸附是浸出的重要條件。然而細(xì)胞的吸附又受到許多因素的影響，如細(xì)胞與礦物自身的表面性質(zhì)，溫度、pH、礦漿濃度、粒度等環(huán)境因素[14?16]。在浸礦初期，細(xì)菌在礦物表面的吸附取決于細(xì)菌與礦物的疏水性和表面電性[17?18]。

圖3 At. thiooxidans細(xì)胞在黃銅礦表面的吸附形貌

萃取有機(jī)物的成分復(fù)雜，且含有大量的極性基團(tuán)。而礦物本身在微觀層面存在著細(xì)小空隙、以及分布不均的表面活性位點(diǎn)[19]。當(dāng)?shù)V物與萃取有機(jī)物發(fā)生固?液接觸時(shí)，礦物表面的活性位點(diǎn)極易與極性基團(tuán)相吸引，發(fā)生吸附作用。使礦物的表面性質(zhì)發(fā)生變化。由圖5(a)可知，隨著有機(jī)相中LIX984N濃度的升高，黃銅礦表面的接觸角由本身的35°逐漸增大到63°左右，其表面疏水性改變十分明顯。另一方面，礦石受不同濃度LIX984N的有機(jī)相污染后，電位整體減小，電負(fù)性更低(見圖5(b))。這主要是由于LIX984N由親水的極性基和親油的非極性基組成的兩親分子。這種兩親分子會(huì)優(yōu)先吸附在礦物表面[20]，使其疏水性增強(qiáng)，有機(jī)相中其他物質(zhì)也會(huì)吸附在礦物表面，導(dǎo)致接觸角變大。而其中的極性官能團(tuán)為羥基(—OH)、肟基 (CN—OH)[21]，使其表面負(fù)電荷增大。因此，萃取有機(jī)物的吸附導(dǎo)致礦物界面疏水性增加，電負(fù)性增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)菌在礦物表面的初級吸附。然而，盡管菌細(xì)胞在受染礦石表面的吸附速度和吸附量增加(見圖2)，但生物浸銅率仍然降低(見圖4(d))。高細(xì)胞吸附率并不意味著高浸出率。

圖4 At. thiooxidans菌浸出低品位黃銅礦過程中相關(guān)參數(shù)隨時(shí)間的變化

圖5 萃取有機(jī)物對低品位黃銅礦表面性質(zhì)的影響

通常，附著在礦石表面的浸礦細(xì)菌會(huì)代謝分泌出一些特殊的多糖、脂類、蛋白質(zhì)等產(chǎn)物，它們聚集形成一層胞外聚合物(EPS)。EPS的產(chǎn)生是細(xì)胞吸附的重要生化原因，它不僅可以促使細(xì)菌的粘附更加緊密，而且成為浸礦反應(yīng)的主要場所[22]，通過絡(luò)合在其基團(tuán)上的Fe3+來氧化溶解金屬硫化礦，加快浸礦作用[23?24]。

在潔凈和受污染MAC培養(yǎng)基中接種等量同批次菌液，在相同條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，分別采用核酸染料Syto9與熒光素標(biāo)記的刀香豆素ConA對細(xì)胞及其胞外多聚物進(jìn)行染色。Syto9可以通過被動(dòng)運(yùn)輸擴(kuò)散透過細(xì)胞壁，與DNA結(jié)合進(jìn)而染色，而ConA可以對細(xì)菌生物膜多糖進(jìn)行染色表征。利用激光共聚焦顯微鏡觀察萃取有機(jī)物對菌EPS分泌的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6(a)顯示在正常潔凈培養(yǎng)基中生長的菌完成了良好的增值，且細(xì)菌在增殖過程中正常分泌EPS(紅色)，一些細(xì)胞的EPS在生長過程中脫落，呈現(xiàn)出裸露的綠色細(xì)胞。而由圖6(b)可見，未見菌胞外EPS存在，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不夠完整，僅少量保持桿狀形態(tài)。該結(jié)果表明可能萃取有機(jī)物對菌的EPS分泌有影響，但還不能排除萃取有機(jī)物與ConA發(fā)生作用而影響染色結(jié)果的可能。萃取有機(jī)物影響下菌的染色與CLSM形貌觀察尚待深入研究。

為進(jìn)一步考察萃取有機(jī)物對菌EPS分泌的影響，通過SEM觀察吸附在受有機(jī)物污染的黃銅礦表面的菌細(xì)胞形態(tài)(見圖7，同批次菌種，接種48 h取樣)，同樣發(fā)現(xiàn)在萃取有機(jī)物存在的環(huán)境中，附著細(xì)胞外未見EPS存在，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不夠完整，之前的研究也證明銅萃取有機(jī)物會(huì)破壞浸礦細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[8]；而正常生長的菌胞外明顯可見EPS的形成。推測在萃取有機(jī)物影響下，菌的胞外多聚物分泌受到了抑制。

吸附在受有機(jī)物污染礦石表面的菌，一方面因萃取有機(jī)物的屏蔽會(huì)在局部減少了與礦物的深度接觸，另一方面因萃取有機(jī)物的脅迫，生長活性降低，生長初期EPS的分泌受到阻礙，進(jìn)而導(dǎo)致了浸出效率的降低。

圖6 At. thiooxidans菌胞外的CLSM形貌

圖7 黃銅礦表面At. thiooxidans菌胞外EPS的SEM像

3 結(jié)論

1) 萃取有機(jī)物的吸附增強(qiáng)了低品位黃銅礦表面的疏水性與電負(fù)性，使菌的吸附率增加19%。

2)菌浸出受萃取有機(jī)物污染的低品位黃銅礦時(shí)，細(xì)胞生長速度降低9%，銅浸出率降低29%。高細(xì)胞吸附率并不意味著高浸出率。

3) 在萃取有機(jī)物脅迫下，細(xì)菌胞外聚合物難以生成，影響生物膜的構(gòu)建。

4) 礦石表面被有機(jī)膜覆蓋、細(xì)胞新陳代謝受抑制、EPS分泌減少，是導(dǎo)致被萃取有機(jī)物污染的低品位黃銅礦浸出率降低的主要原因。

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Bioleaching of copper solvent extraction organics contaminated-chalcopyrite ores by

YU Hua-long1, LIU Xiao-rong1, SHEN Jun-hui1, CHI Dao-jie2

(1. School of Materials Science and Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China; 2. School of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China)

The impacts of copper solvent extraction (SX) organics on bioleaching microorganism are attracting more and more attentions. The attachment of the cellsof() on the low grade chalcopyrite ore, contaminated by SX organics, and the subsequent bioleaching process were investigated. The results show that the attachment of the cells to the SX organics contaminated-ores increases by 19% since the surface hydrophobicity and electronegativity of the ores are enhanced by SX organics. However, a higher level of attachment of the cells does not mean the better bioleaching efficiency indeed. For bioleaching of the contaminated low-grade chalcopyrite ores, the metabolic rate ofand the copper extraction efficiency decreases by 9% and 29%, respectively. Impacted by SX organics, the EPS secretion ofseems to be inhibited, which retards the construction of the biofilm. Conclusively, being covered surface of the ores, inhibited metabolism and EPS secretion for the cells might be the primary reasons for the low bioleaching efficiency of the SX organics contaminated-ores.

; copper solvent extraction; bacterial adsorption; extracellular polymeric substances; chalcopyrite

Project(51474150) supported by the National Natural Science Foundation of China

2017-02-14;

2017-07-20

LIU Xiao-rong; Tel: +86-21-60873439; E-mail: xrliu@sit.edu.cn

1004-0609(2018)-04-0823-07

TF18

A

10.19476/j.ysxb.1004.0609.2018.04.21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51474150)

2017-02-14；

2017-07-20

劉曉榮，教授，博士；電話：021-60873425；E-mail: xrliu@sit.edu.cn

(編輯 龍懷中)