細(xì)胞凋亡因子表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病相關(guān)性研究

胡 瑾

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)三科，河北 張家口 075000

神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病(neurodegenerative diseases，NDD)是以一組原因不明的以神經(jīng)元變性為基礎(chǔ)的慢性進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括帕金森病(Parkinson′s disease，PD)、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、亨廷頓舞蹈病(Huntington′s disease，HD)和阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)等，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康[1]。目前，NDD發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，探討發(fā)病機(jī)制對(duì)疾病防治有重要意義[2]。Trim27不僅可參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞周期、腫瘤細(xì)胞遷移，還可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]；P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)是MAPK家族的重要成員，可通過(guò)調(diào)節(jié)和阻斷關(guān)鍵的信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[4-5]。目前，Trim27、P38MAPK、JNK與NDD發(fā)生關(guān)系的研究報(bào)道尚少。本研究通過(guò)比較NDD患者和健康人群Trim27、P38MAPK、JNK的變化，探討Trim27、P38MAPK、JNK與NDD發(fā)生的關(guān)系，以期為臨床治療NDD提供新的有效治療靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1—12月在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科住院的NDD患者100例設(shè)為NDD組，AD的診斷參照美國(guó)國(guó)立老化研究所與阿爾茨海默病協(xié)會(huì)診斷指南協(xié)作組推薦的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，PD的診斷參照中國(guó)帕金森病的診斷標(biāo)準(zhǔn)(2016版)[7]提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，男性38例，女性62例；年齡60～82歲，平均(69.71±3.18)歲；AD患者59例，臨床癡呆量表(clinical dementia rating，CDR)評(píng)分≤2分， PD患者41例。選取年齡、性別相匹配的同期健康體檢者100例作為健康組，其中，男性42例，女性58例，平均年齡(67.98±3.51)歲。兩組患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心、肝、腎及其他全身性系統(tǒng)性疾病；(2)近期有重大手術(shù)、外傷史；(3)遺傳病史；(4)惡性腫瘤；(5)精神系統(tǒng)疾??；(6)病例資料不完整。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集 所有研究對(duì)象均行空腹靜脈采血，用EDTA-K2抗凝管(2 ml)收集，離心10 min，分離血漿，-70℃保存。

1.2.2 Western blot檢測(cè)方法 采用Western blot技術(shù)檢測(cè)Trim27、P38MAPK、JNK在PBMC中的表達(dá)：(1)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。血樣標(biāo)本去血漿后形成濃縮血液，等體積1 640培養(yǎng)液稀釋，先于50 ml離心試管內(nèi)倒入15 ml淋巴細(xì)胞分離液，再加入稀釋后血液，使其保持分層狀態(tài)，2 500 r/min離心30 min，吸除上清液使液面至白細(xì)胞團(tuán)上2 cm處，剩余換至新的離心試管中，加入1 640培養(yǎng)液至45 ml。1 600 r/min離心5 min，吸除上清液，加1 640培養(yǎng)液使重懸細(xì)胞后，再加入1 640培養(yǎng)液至45 ml，1 600 r/min離心5 min，吸除上清液，獲得PMBC。(2)PBMC蛋白提取。取PBMC細(xì)胞5×106個(gè)/ml，加入裂解緩沖液(RIPA緩沖液)5 ml，攪拌均勻，加入100 μl的蛋白上樣裂解液，處理樣品后，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，取出膠后放入盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的培養(yǎng)液中，剪裁與膠大小一致的聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，將其在甲醇中浸泡3～5 min，激活活性成分，再與濾紙一起泡入轉(zhuǎn)膜液，按照三層“濾紙-膠-膜-三層濾紙”順序轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜成功后用膜用TBST緩沖液漂洗，浸泡于含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中，室溫下輕搖孵育1 h。加入一抗，分別加入兔來(lái)源Trim27、P38MAPK、JNK、P-P38MAPK、P-JNK單克隆一抗(美國(guó)Cell signaling公司)，Trim27、P38MAPK、JN的稀釋比例為1∶1 000，P-P38MAPK、P-JNK稀釋比例為1∶500，GAPDH稀釋比例為1∶10 000。一抗孵育結(jié)束后，TBST漂洗膜3次，每次5～10 min。分別加入二抗：羊抗兔稀釋比例1∶5 000，室溫下輕搖孵育1h，二抗孵育結(jié)束后TTBS漂洗膜3次，每次5～10 min。使用辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法，將底物A、B液等比例稀釋混合后，加入用保鮮膜封好的PVDF膜中，暗房顯影，觀察Trim27、P38MAPK、JNK蛋白總的表達(dá)量及P38MAPK、JNK磷酸化形式(P-P38MAPK、P-JNK)表達(dá)量(用灰度值比值表示)。Trim27灰度值比值=Trim27灰度值/GAPDH灰度值。

P-P38MAPK灰度值比值=P-P38MAPK灰度值/P38MAPK灰度值

P-JNK灰度值比值=P-JNK灰度值/JNK灰度值

2 結(jié)果

2.1 NDD組與健康組Trim27、P38MAPK、JNK表達(dá)水平比較 NDD組和健康組患者P38MAPK、JNK表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而NDD組患者Trim27表達(dá)水平高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NDD組與健康組Trim27、P38MAPK、JNK表達(dá)水平比較

2.2 NDD組與健康組P-P38MAPK、P-JNK表達(dá)水平比較 NDD組患者P-P38MAPK、P-JNK表達(dá)均明顯高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 NDD組與健康組P-P38MAPK、P-JNK表達(dá)水平

3 討論

NDD是一組以原發(fā)性神經(jīng)元變性為基礎(chǔ)的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可能為神經(jīng)組織在演化、發(fā)育、成熟等過(guò)程中出現(xiàn)的分子生物障礙，常見(jiàn)的疾病類型包括AD、PD等，具有病程長(zhǎng)、致殘率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活能力[8]。目前，NDD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，也缺乏有效的預(yù)防、根治手段。因此，探討NDD發(fā)病機(jī)制，一直是國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)研究問(wèn)題。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可能參與NDD發(fā)生[9-10]。Trim27最初是作為RET基因(編碼細(xì)胞膜受體酪氨酸激酶的基因)的融合伴侶而被確認(rèn)，其屬于Trim家族的一員，既往關(guān)于Trim27的研究多集中在腫瘤方面，但其調(diào)控炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的作用也不容忽視[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中存在炎癥反應(yīng)，且炎性反應(yīng)是NDD細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一[13]，Trim27對(duì)炎癥信號(hào)通路起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可能參與NDD發(fā)生。Trim27不僅可直接調(diào)控細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)提高P53穩(wěn)定性及促進(jìn)PKB的蛋白酶體降解增強(qiáng)電離輻射等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，NDD患者Trim27表達(dá)水平明顯高于健康組，這一結(jié)果說(shuō)明Trim27可能參與NDD患者細(xì)胞凋亡。

MAPK在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，MAPK信號(hào)通路可在多種受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)等一系列病理生理過(guò)程。JNK通路、P38MAPK通路是MAPK諸多通路中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要通路[15-16]。MAPK通常由細(xì)胞因子、生理應(yīng)激反應(yīng)、滲透壓變化等激活，激活途徑可能為細(xì)胞受刺激后，首先MAPKKK被磷酸化，繼而由磷酸化激活MAPKK(對(duì)P38有較高的特異性)，激活的磷酸化MAPKK再通過(guò)蘇氨酸、酪氨酸雙位點(diǎn)的磷酸化激活JNK、P38MAPK[17]。目前，關(guān)于被激活的JNK、P38MAPK調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未完全明確，其中，JNK介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能為活化轉(zhuǎn)錄因子Elkl、參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，P38MAPK可能通過(guò)作用于下游的Caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，NDD患者P38MAPK、JNK表達(dá)水平與健康組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，但其活化形式P-P38MAPK、P-JNK水平較健康組顯著升高，這一結(jié)果說(shuō)明，P38MAPK、JNK活化形式高表達(dá)可能參與NDD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。Jha 等[19]指出，P38MAPK通路、JNK通路異?？赡芤餚D患者大腦促凋亡和抗凋亡失衡。本研究中，AD和PD患者Trim27、P-P38MAPK、P-JNK表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，考慮細(xì)胞凋亡可能是AD和PD重要發(fā)病機(jī)制，Trim27、P-P38MAPK、P-JNK表達(dá)異常并非由某一種疾病導(dǎo)致，可能存在于多種NDD中。

綜上所述，與健康人群比較，NDD患者外周血Trim27、P-P38MAPK、P-JNK表達(dá)水平均顯著增高，其調(diào)控的細(xì)胞凋亡可能參與NDD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

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(收稿日期：2018-03-20)