體外誘導(dǎo)禽巴氏桿菌鏈霉素耐藥株及耐藥機(jī)制的初步分析

汪最 孔令嚴(yán) 邵華斌 盧琴 羅青平 楊玉瑩

摘要：為了研究多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）對鏈霉素（Streptomycin，Str）藥物敏感性變化及其耐藥機(jī)制，采用體外誘導(dǎo)法對禽源Pm親本敏感株（C48-1）進(jìn)行誘導(dǎo)后成功獲得Str耐藥株，并對Str耐藥株的最小抑菌濃度（MIC）、生化特性、生長曲線、耐藥穩(wěn)定性、耐藥基因點(diǎn)突變以及耐藥逆轉(zhuǎn)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與親本株相比，Str耐藥株生化特性與生長曲線無顯著差異，MIC值由8 μg/mL上升至1 024 μg/mL；發(fā)現(xiàn)耐藥基因StrA、StrB，且核糖體基因rpsL編碼的氨基酸發(fā)生了Lys43→Thr突變；耐藥逆轉(zhuǎn)性試驗(yàn)中羰基氰氯苯腙（CCCP）將Str耐藥株MIC值降為16 μg/mL。逐步遞增藥物濃度可以誘導(dǎo)禽源Pm對氨基糖苷類藥物的耐藥性，其耐藥機(jī)理為磷酸轉(zhuǎn)移酶類對氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)的修飾作用，核糖體靶位點(diǎn)突變和外排泵的過量表達(dá)。

關(guān)鍵詞：禽源多殺性巴氏桿菌；體外誘導(dǎo)；鏈霉素；耐藥基因；位點(diǎn)突變；耐藥機(jī)制

中圖分類號：S852.61+5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）08-0096-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.024

Characterization of Sreptomycin-resistant Avian Pasteurella multocida in Vitro Induction and Preliminary Analysis of Resistance Mechanism

WANG Zui1，2，KONG Ling-yan2，SHAO Hua-bin2，LU Qin2，LUO Qing-ping2，YANG Yu-ying1

（1.College of Animal Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriosis（Ministry of Agriculture），

Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to study the drug susceptibility to sreptomycin（Str） and its drug resisitance mechanism of avian Pasteurella multocida（Pm），a Str-resistant avian Pm was obtained via in vitro induction with gradually increasing drug concentrations to the standard strain named C48-1. The minimal inhibitory concentration（MIC），biochemical characteristics， growth curve，stability of drug resistance，drug resistance gene site mutation and drug resistance reversal of the Str-resistant strain was analyzed. The results showed that compared with the parent strain， the biochemical characteristics and growth curve had no significant difference，the MIC of the Str-resistant strain was increased from 8 μg/mL to 1 024 μg/mL. What more，the drug resistance gene StrA and StrB were found and the amino acid sequence encoded by the rpsL gene had an amino acid exchange of Lys43→Thr. In the drug resistance reversal test， carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone （CCCP） reduced the MIC of the Str-resistant strain to 16 μg/mL. In total，it shows that gradually increasing drug concentration can induce Pm resistance to aminoglycosides in vitro. Its mechanism is the modification of aminoglycoside antibiotics by phospho-transferase，the mutation of ribosomal protein and the over expression of efflux pumps.

Key words： avian Pasteurella multocida； in vitro induction； sreptomycin； drug resistance gene； site mutation； resistance mechanism

禽源多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是引起禽霍亂的致病菌，該病屬于急性、熱性、高致病性傳染病[1]。在中國引起禽霍亂的病原菌主要是莢膜血清A型Pm[2]。目前對于該病的控制措施，主要采用藥物防治，尤其是抗生素如鏈霉素、磺胺嘧啶等效果較好，但耐藥菌株的出現(xiàn)對該病的防控帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3]。

氨基糖苷類藥物屬于最早投入臨床使用的抗菌藥物之一，由于長期、頻繁、大劑量使用，近年來臨床分離出的Pm對氨基糖苷類藥物出現(xiàn)普遍耐藥現(xiàn)象，部分分離株對Str等氨基糖苷類藥物已達(dá)到了高度耐藥[4]。已有研究表明，細(xì)菌對氨基糖苷類藥物耐藥機(jī)制主要分為核糖體靶位修飾或點(diǎn)突變、氨基糖苷類抗生素修飾酶的修飾作用和外排泵的外排作用[5]。而目前公認(rèn)的Pm耐氨基糖苷類藥物的主要機(jī)制是其質(zhì)?；蛉旧w上攜帶多種氨基糖苷類鈍化酶基因[6]，其他耐藥機(jī)制的研究較少。

為研究多殺性巴氏桿菌對氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制，本試驗(yàn)以禽源多殺性巴氏桿菌代表株C48-1為研究對象，應(yīng)用體外誘導(dǎo)法誘導(dǎo)出Str耐藥株，并對其耐藥基因、核糖體靶位突變以及耐藥逆轉(zhuǎn)性進(jìn)行了分析，旨在為后續(xù)耐藥機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌ATCC25922，購自廣州環(huán)凱微生物有限公司；禽巴氏桿菌C48-1株，購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 主要試劑

鏈霉素、CCCP、利血平、奧美拉唑、維拉帕米，購自索萊寶公司；麥?zhǔn)媳葷峁?、生化試劑管，購自廣州環(huán)凱微生物有限公司；Taq酶等PCR試劑，購自諾唯贊公司；MH、TSA、TSB培養(yǎng)基，購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 MIC值的測定 參照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI）[7]推薦的微量稀釋法檢測鏈霉素對親本株C48-1的MIC值，以大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌。培養(yǎng)物置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

1.3.2 巴氏桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo) 采用體外誘導(dǎo)法增加藥物濃度誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)菌株C48-1對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性。將菌株在含有1/2 MIC抗生素的TSA培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每3 d轉(zhuǎn)接1次，每周檢測1次MIC值，同步設(shè)質(zhì)控菌ATCC25922作為平行對照，以保證試驗(yàn)的可靠性。以CLSI的臨界濃度（Break point）作為耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)，鏈霉素耐藥為不低于64 μg/mL。為保證菌株沒有污染，每代都利用PCR技術(shù)檢測誘導(dǎo)菌株是否為巴氏桿菌。

1.3.3 巴氏桿菌耐藥株的穩(wěn)定性檢測

1）誘導(dǎo)株的MIC值穩(wěn)定性檢測。將誘導(dǎo)獲得的鏈霉素耐藥株轉(zhuǎn)接于無抗性的TSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每天轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)傳代20代后檢測MIC值，以判斷StrR耐藥性的穩(wěn)定性。

2）生理生化特性檢測。對培養(yǎng)的鏈霉素耐藥株和親本株單個菌落進(jìn)行葡萄糖、蔗糖、甘露醇、半乳糖、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、木糖、甲基紅、阿拉伯糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、明膠酶、氧化酶、硝酸鹽還原、尿素、V-P、吲哚等生化試驗(yàn)，觀察其生理生化特性。

3）誘導(dǎo)株及其親本株生長曲線測定。分別接種鏈霉素耐藥株和親本株的單個菌落于TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（約3×108 CFU/mL），調(diào)節(jié)菌液的起始OD600 nm值一致，吸取100 μL菌液轉(zhuǎn)接于100 mL TSB培養(yǎng)中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔1 h取樣100 μL，在分光光度計(jì)上測定OD600 nm值，記錄結(jié)果。以時間為橫坐標(biāo)，OD600 nm值為縱坐標(biāo)，繪制各菌株的生長曲線。

1.3.4 耐藥株耐藥相關(guān)基因檢測 根據(jù)GenBank現(xiàn)有文獻(xiàn)檢索Pm相應(yīng)的氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因，對耐藥菌株的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，檢測耐藥相關(guān)基因序列是否正確以及是否發(fā)生靶位突變。氨基糖苷類藥物相關(guān)耐藥基因及引物序列見表1。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)性耐藥試驗(yàn) 利用瓊脂二倍稀釋法測定CCCP、利血平、奧美拉唑、維拉帕米對鏈霉素耐藥株的最小抑菌濃度，然后以1/4 MIC的CCCP、利血平、奧美拉唑、維拉帕米溶液加入含有各濃度梯度的鏈霉素平皿內(nèi)（不含鏈霉素的平皿為對照）。檢測CCCP、利血平、奧美拉唑、維拉帕米對受試菌鏈霉素MIC值影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴氏桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)

采用體外逐步誘導(dǎo)法構(gòu)建出Str的誘導(dǎo)耐藥菌株，標(biāo)記為StrR，依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)對親本株C48-1和誘導(dǎo)株StrR的MIC值進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。C48-1的MIC值為8 μg/mL；StrR的MIC值為1 024 μg/mL，是親本株的128倍，為高度耐藥。利用Pm的特異性引物對StrR菌株進(jìn)行PCR檢測，得到明亮的目的條帶，表明獲得了高度耐藥的Pm鏈霉素耐藥菌株。

2.2 巴氏桿菌耐藥株的穩(wěn)定性檢測

將誘導(dǎo)獲得的耐藥株連續(xù)傳20代后檢測MIC值，其MIC值保持為1 024 μg/mL，表明成功獲得了穩(wěn)定的Pm鏈霉素耐藥菌株。對誘導(dǎo)株和親本株分別進(jìn)行生化特性檢測，結(jié)果見表3，誘導(dǎo)株和親本株在生理生化特性上無差異，誘導(dǎo)株和親本株生長曲線見圖1，總體上誘導(dǎo)株與親本株無較大差異，誘導(dǎo)株達(dá)到對數(shù)生長期的時間稍微延遲，這可能是誘導(dǎo)株在鏈霉素誘導(dǎo)過程中為了更好地適應(yīng)藥物環(huán)境，從而放緩了生長速率。

2.3 耐藥株耐藥相關(guān)基因檢測

對耐藥株StrR耐藥相關(guān)基因進(jìn)行PCR檢測見圖2，成功擴(kuò)增出了磷酸轉(zhuǎn)移酶類的StrA、StrB基因，核糖體30 s亞基上的rpsE、rpsL和rrs基因，而腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶類AadB、AadA25、AadA14、AadA1基因和乙酰轉(zhuǎn)移酶類AacA4基因均未擴(kuò)增出條帶。將擴(kuò)增的StrA、StrB、rpsE、rpsL和rrs基因全長測序后與親本株比對發(fā)現(xiàn)，StrA、StrB、rpsE和rrs基因均未發(fā)生突變，只有rpsL基因在第128個堿基發(fā)生了突變由（A→C），從而使相應(yīng)的第43位氨基酸也發(fā)生了突變（Lys43→Thr），由于在所有的不同程度耐藥的誘導(dǎo)菌株中該位點(diǎn)都發(fā)生了突變（圖3），可以確定該位點(diǎn)突變不是導(dǎo)致高度耐藥的主要因素。

2.4 逆轉(zhuǎn)性耐藥試驗(yàn)結(jié)果

通過瓊脂二倍稀釋法測得CCCP、利血平、奧美拉唑、維拉帕米對鏈霉素耐藥株的MIC值分別為20、40、60、60 μg/mL。1/4MIC CCCP溶液導(dǎo)致耐藥株的MIC值顯著下降，鏈霉素MIC值從初始的1 024 μg/mL降低為16 μg/mL（臨界值為64 μg/mL），而利血平、奧美拉唑、維拉帕米對耐藥株MIC值并無明顯影響（表4），說明受試菌在外排泵抑制劑CCCP的作用下發(fā)生了鏈霉素耐藥性的逆轉(zhuǎn)。

3 小結(jié)與討論

氨基糖苷類抗生素因其對禽巴氏桿菌有良好滅殺作用而被廣泛應(yīng)用，但耐藥性問題也日趨嚴(yán)重。對于Pm氨基糖苷類抗生素耐藥機(jī)制，國內(nèi)外主要集中于檢測分離株是否在質(zhì)?；蚧蚪M上攜帶StrA、StrB等耐藥基因，而對核糖體靶位突變和外排泵的過量表達(dá)等耐藥機(jī)制研究較少。

為了研究Pm氨基糖苷類抗生素耐藥機(jī)制，本試驗(yàn)采用體外逐步誘導(dǎo)法成功誘導(dǎo)出Pm的Str高度耐藥菌株，MIC值達(dá)到1 024 μg/mL，其生物學(xué)特性與親本株表現(xiàn)一致，耐藥性也穩(wěn)定存在。磷酸轉(zhuǎn)移酶、腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和乙?；D(zhuǎn)移酶類屬于氨基糖苷類抗生素修飾酶，是介導(dǎo)氨基糖苷類耐藥最為廣泛的途徑[8]。本試驗(yàn)對Str耐藥株所攜帶耐藥基因進(jìn)行PCR檢測，只發(fā)現(xiàn)了磷酸轉(zhuǎn)移酶類的StrA、StrB基因，該類基因可以對氨基糖苷類抗生素上的磷酸鹽基團(tuán)進(jìn)行催化轉(zhuǎn)移[9]，使其無法作用于細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。金天明等[10]發(fā)現(xiàn)臨床分離的禽源Pm鏈霉素耐藥株均在StrA基因編碼的第204位氨基酸處存在突變，這可能是介導(dǎo)鏈霉素耐藥的主要因素，而本研究并未發(fā)現(xiàn)StrA、StrB有突變發(fā)生。有研究表明，rpsL基因編碼的核糖體蛋白S12和rrs基因編碼的16S rRNA構(gòu)成了核糖體的蛋白質(zhì)合成中心，也是鏈霉素主要的作用靶點(diǎn)[11]，rpsE基因編碼的核糖體蛋白S5突變能夠介導(dǎo)細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素耐藥[12]，所以rpsL、rrs和rpsE基因突變會導(dǎo)致鏈霉素耐藥。通過對誘導(dǎo)株rpsL、rrs、rpsE基因全長測序，發(fā)現(xiàn)rrs和rpsE基因沒有發(fā)生突變，所以誘導(dǎo)株鏈霉素耐藥與rpsE和rrs基因突變無關(guān)。而rpsL基因發(fā)生了Lys43→Thr突變，該位點(diǎn)是結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥株中最常見的突變位點(diǎn)，在結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥中起主要作用[13]。由于在不同敏感程度誘導(dǎo)株中均發(fā)生了Lys43→Thr突變，說明該位點(diǎn)突變確實(shí)與Pm鏈霉素耐藥相關(guān)，但并不是Pm鏈霉素高度耐藥的原因。逆轉(zhuǎn)性耐藥試驗(yàn)中，外排泵抑制劑CCCP對誘導(dǎo)株鏈霉素耐藥產(chǎn)生了顯著逆轉(zhuǎn)效果，誘導(dǎo)株MIC值由1 024 μg/mL降為16 μg/mL。作為實(shí)驗(yàn)室最常用的外排泵抑制藥物，CCCP通過損耗細(xì)胞膜的質(zhì)子動力來阻斷外排泵能量來源，從而影響藥物的外排[14]，但CCCP是非特異性外排泵抑制劑，能抑制主動外排作用卻不能確定外排泵的種類[15]，具體是對哪種或哪幾種外排泵起作用，還有待進(jìn)一步研究。通過CCCP耐藥逆轉(zhuǎn)效果，可以看出外排泵過量表達(dá)是誘導(dǎo)株鏈霉素高度耐藥的原因。所以，誘導(dǎo)株耐藥機(jī)理為磷酸轉(zhuǎn)移酶類對氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)的修飾作用，核糖體靶位點(diǎn)突變以及外排泵的過量表達(dá)。

本研究初步分析了耐藥株中可能存的耐藥機(jī)制，后續(xù)將利用RNA-Seq技術(shù)對誘導(dǎo)耐藥株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以期發(fā)現(xiàn)其他耐藥機(jī)制，為防止耐藥性的產(chǎn)生和研制新藥提供理論依據(jù)。

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