生化法處理后的鏈霉素廢水出水對斑馬魚SOD活性和MDA含量的影響?yīng)?/h1>
2015-09-10 12:21:56趙月曹志會王冰等
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年8期
趙月+曹志會+王冰等
摘要： 采用暴露試驗(yàn)方法，研究了10%、20%、30%、40%體積百分比的生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水15 d 內(nèi)對斑馬魚肌肉組織超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影響。結(jié)果顯示，斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量在暴露過程中以誘導(dǎo)為主，經(jīng)過生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水比例達(dá)到10%時就可以對斑馬魚產(chǎn)生氧化損傷效應(yīng)，但是比例達(dá)到40%時其對斑馬魚的氧化損傷程度并未超過其抗氧化防御系統(tǒng)的閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)最終達(dá)到了新的平衡，說明魚體抗氧化防御系統(tǒng)具有自我調(diào)節(jié)的功能。此外，斑馬魚SOD活性、MDA含量均對鏈霉素生產(chǎn)廢水的脅迫有應(yīng)激反應(yīng)，兩者有協(xié)同性，但是SOD活性比MDA含量更敏感。
關(guān)鍵詞： 鏈霉素；斑馬魚；抗氧化防御系統(tǒng)
中圖分類號： X703 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A
文章編號：1002-1302（2015）08-0348-03
隨著工業(yè)的發(fā)展，工業(yè)廢水排放對水生態(tài)系統(tǒng)、人類健康構(gòu)成了巨大威脅，同時給環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估和管理帶來了挑戰(zhàn) [1]。目前我國工業(yè)廢水排放的監(jiān)督管理以理化監(jiān)測為主，能快速定量測定某些廢水中的污染物含量，但對于組分復(fù)雜的工業(yè)廢水，難以用理化分析方法闡明其組分。因此，建議采用水生生物毒性試驗(yàn)來反映廢水的綜合毒性 [2-3]。制藥企業(yè)污水處理廠、城市污水處理廠的污水處理工藝對制藥廢水中的污染物質(zhì)去除仍不夠徹底 [4]。王麗萍等利用鯉魚、鯽魚對污水處理廠廢水的急性毒性進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，鯉魚對水質(zhì)毒性的敏感性高于鯽魚，出水對魚的毒性主要是由水中游離氨引起的 [5]。李麗君等用斑馬魚檢測幾家工業(yè)污染源廢水毒性，對各行業(yè)廢水的毒性、污水處理的效果以及污水的綜合毒性進(jìn)行了客觀評價，結(jié)果顯示，大部分行業(yè)的工業(yè)廢水經(jīng)處理后仍具有毒性 [4]。沈洪艷等采用暴露試驗(yàn)法研究了青霉素、土霉素混合廢水的出水不同暴露濃度對斑馬魚肌肉超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影響，結(jié)果表明，該廢水對斑馬魚機(jī)體造成了一定的氧化損傷 [6]。錦鯉長期暴露于鏈霉素廢水中會對其抗氧化防御系統(tǒng)及抗氧化能力產(chǎn)生影響 [7]。斑馬魚是國際標(biāo)準(zhǔn)組織推薦的試驗(yàn)用魚，斑馬魚成魚個體比其他魚種小，便于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，具有繁殖能力強(qiáng)、價格便宜等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于胚胎發(fā)育生物學(xué)研究、動物學(xué)基因表達(dá)研究、毒物在生物體內(nèi)殘留累積效應(yīng)研究、污染物對于魚類急性毒性研究等 [8-9]。本研究選取某大型鏈霉素生產(chǎn)企業(yè)污水處理廠生化法處理后的二沉池出水為水樣（以下簡稱鏈霉素廢水出水），以斑馬魚為研究對象，評估鏈霉素廢水出水對魚體肌肉組織SOD活性、MDA含量的影響，旨在為評價制藥工業(yè)廢水處理工藝有效性以及處理后出水的生態(tài)安全性提供依據(jù)。
1 材料與方法
1 1 儀器和試劑
UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）、DK-S26 型恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、TG16-WS 臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、JPBJ-608型便攜式溶解氧測定儀（上海精密科學(xué)與儀器有限公司）、EL204型電子分析天平（梅特勒-上海托利多有限公司）、FE20型pH計(jì)（梅特勒-上海托利多有限公司）、XK96-B型快速混勻器（姜堰新康醫(yī)療器械有限公司）、BBC-226STV海爾家用冰箱、SYZ-A型石英高純水蒸餾器（金壇市宏華儀器廠）、WAD-TH型硬度計(jì)、手動式勻漿器、溫度計(jì)、加熱棒、移液管等。試驗(yàn)用SOD、MDA、考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，醋酸、乙醇、生理鹽水均購自天津永大化學(xué)試劑公司。
1 2 受試生物
選用斑馬魚為受試生物，由河北省石家莊市水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供，體長為（34 05±0 43） mm，體質(zhì)量為（0 24±0 03） g， 魚苗經(jīng)5%食鹽水消毒后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，用 48 h 曝氣的脫氯自來水在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7 d用于試驗(yàn)，試驗(yàn)水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，馴養(yǎng)期間斑馬魚死亡率<4%。為防止餌料產(chǎn)生影響，試驗(yàn)前24 h停止喂食，整個急性試驗(yàn)期間不喂食。
1 3 方法
預(yù)試驗(yàn)：在27 cm×13 cm×15 cm的玻璃水族缸中每缸盛放4 L試液，分別設(shè)置8個預(yù)試驗(yàn)濃度組，鏈霉素出水體積百分比分別為：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。用曝氣48 h的除氯自來水進(jìn)行稀釋，水質(zhì)指標(biāo)滿足GB 11607—1989 《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》。每組隨機(jī)放入10尾魚，連續(xù)試驗(yàn) 96 h，每天更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)試驗(yàn)96 h后，并未觀察到任何1個試驗(yàn)組的斑馬魚全部死亡。急性毒性試驗(yàn)：根據(jù)上述預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行急性試驗(yàn)濃度設(shè)置，鏈霉素廢水出水選擇20%、40%、60%、80%、100%體積百分比來觀察鏈霉素廢水出水對斑馬魚造成的影響，每組10尾魚。亞急性毒性試驗(yàn)：對于鏈霉素廢水出水，設(shè)定亞急性毒性試驗(yàn)濃度為：10%、20%、30%、40%，研究不同暴露濃度鏈霉素廢水出水對斑馬魚的氧化損傷。試驗(yàn)設(shè)置1個空白組、4個試驗(yàn)組，每個試驗(yàn)組設(shè)置3個平行組。在5 L魚缸中分別放入4 L試驗(yàn)液，充分混合曝氣后將馴養(yǎng)的斑馬魚隨機(jī)放入各個試驗(yàn)組中，每組投放20尾魚，并進(jìn)行連續(xù)曝氣。亞急性毒性試驗(yàn)歷時 15 d，每天至少測定1次試驗(yàn)液中的溶解氧含量、pH值、硬度、水溫。采用靜態(tài)置換法，每天換水，分別于3、6、9、12、15 d測定斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量。
1 4 樣品處理
每次從相應(yīng)的試驗(yàn)組中取5尾試驗(yàn)魚，解剖，取其肌肉組織，在冰冷的0 86%生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量，放入玻璃勻漿管中；用移液器按1 ∶ 9（質(zhì)量體積比）取預(yù)冷的0 86%生理鹽水，加入勻漿管中進(jìn)行勻漿，在冰水浴中進(jìn)行勻漿，充分研磨約8 min，制得10%組織勻漿。將制備好的勻漿液用普通離心機(jī)在3 000 r/min下離心10 min，取其上清液保存于4 ℃冰箱中。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；采用硫代巴比妥酸反應(yīng)（TBA）比色法測定MDA含量。endprint
1 5 試驗(yàn)條件
試驗(yàn)所用廢水來自鏈霉素生產(chǎn)過程中的提煉工段，化學(xué)需氧量（COD）、生化需氧量（BOD5）、懸浮物、氨氮濃度分別為200、50、50、4 12 mg/L，色度為21。試驗(yàn)用水pH值約75，總硬度約100 mg/L，試驗(yàn)溫度為22～24 ℃，溶解氧含量不低于5 mg/L。試驗(yàn)期間用曝氣裝置連續(xù)曝氣，為了保證其濃度，每24 h換1次試驗(yàn)液，每天至少測定1次試驗(yàn)溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量。
1 6 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。
2 結(jié)果與分析
2 1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果
96 h內(nèi)，80%、100%濃度組斑馬魚出現(xiàn)側(cè)翻現(xiàn)象，游動十分遲緩。80%濃度組斑馬魚死亡4尾，100%濃度組斑馬魚死亡5尾。40%、60%濃度組斑馬魚游動緩慢，未出現(xiàn)側(cè)翻。20%濃度組斑馬魚行為未出現(xiàn)明顯異常。黃健等選用鏈霉素對6種海洋微藻進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，只有角毛藻、三角褐指藻在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)（0～500 mg/L）測到了72 h半抑制濃度，EC50分別為346、445 mg/L，其他4種海洋微藻均未測到72 h半抑制濃度 [10]。
2 2 亞急性毒性試驗(yàn)
2 2 1 生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水對斑馬魚肌肉SOD活性的影響 由圖1可知，3 d時，10%試驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)SOD活性比對照增加，但無顯著差異；20%、30%、40%試驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)SOD活性出現(xiàn)顯著性誘導(dǎo)作用，說明生化法處理后的鏈霉素廢水出水能夠引起斑馬魚氧化應(yīng)激反應(yīng)。斑馬魚通過升高SOD活性來抵御 O-2[KG- 2]· 對機(jī)體的侵害作用。6 d時，10%試驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)SOD活性比對照增加；20%、30%試驗(yàn)組則表現(xiàn)出抑制作用，但無顯著性差異；40%試驗(yàn)組表現(xiàn)出顯著抑制作用。這可能是因?yàn)殡S著暴露時間的延長，鏈霉素廢水中污染物在魚體內(nèi)不斷地累積，導(dǎo)致魚體內(nèi)產(chǎn)生大量O-2·，過多的O-2·消耗了SOD，也可能是過量的O-2·對魚體抗氧化酶產(chǎn)生了直接損傷，導(dǎo)致SOD活性降低。9 d時，10%試驗(yàn)組表現(xiàn)為對SOD活性有誘導(dǎo)作用但無顯著差異，其值略高于空白對照組；20%、30%、40%試驗(yàn)組均表現(xiàn)為抑制作用但無顯著性差異，其值略低于空白對照組。12 d時，10%、30%試驗(yàn)組表現(xiàn)出抑制作用但無顯著差異；20%試驗(yàn)組表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用但無顯著性差異；40%試驗(yàn)組表現(xiàn)出顯著誘導(dǎo)作用。15 d時，10%、40%試驗(yàn)組顯現(xiàn)出誘導(dǎo)作用但無顯著差異；20%、30%試驗(yàn)組表現(xiàn)出抑制作用但無顯著差異。綜上所述，生化法處理后的鏈霉素廢水出水比例為10%時對魚體影響是可逆的，并未超過其抗氧化防御系統(tǒng)閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)最終達(dá)到了新的平衡。
2 2 2 生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水對斑馬魚肌肉MDA含量的影響 如圖2所示，3 d時，10%、20%、30%、40%試驗(yàn)組斑馬魚肌肉MDA含量均表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，但是無顯著差異。6 d時，20%、30%試驗(yàn)組斑馬魚肌肉MDA含量均表現(xiàn)為顯著誘導(dǎo)作用。9 d時，30%試驗(yàn)組出現(xiàn)抑制作用但無顯著差異；10%、20%、40%試驗(yàn)組表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用但無顯著差異。試驗(yàn)后期（9～15 d），所有試驗(yàn)組MDA含量均與空白對照組無顯著差異。綜上所述，3 d時所有試驗(yàn)組斑馬魚肌肉MDA含量均表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，說明生化法處理后的鏈霉素廢水出水比例為10%時就已經(jīng)引起了魚體脂質(zhì)過氧化損傷；6 d時20%、30%試驗(yàn)組顯現(xiàn)出顯著誘導(dǎo)效果；9～15 d 時，10%、20%、40%試驗(yàn)組與空白對照組無顯著差異。本試驗(yàn)濃度范圍已經(jīng)引起了斑馬魚脂質(zhì)過氧化損傷，9～15 d時與空白對照組無顯著差異，說明斑馬魚抗氧化防御系統(tǒng)達(dá)到了新的平衡，該試驗(yàn)結(jié)果與SOD活性測定結(jié)果一致。
3 結(jié)論與討論
3 1 生化法處理后的鏈霉素廢水出水對SOD活性影響
SOD是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，主
要分布在胞漿和線粒體的基質(zhì)內(nèi) [11-13]，由于其是唯一1種以自由基為底物的抗氧化酶，因此在活性氧自由基清除方面中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，暴露初期（3 d），暴露組SOD活性較空白組升高，說明斑馬魚在受到外界刺激時，生物體內(nèi)陰離子氧自由基數(shù)量增多，SOD被激活，保護(hù)系統(tǒng)被打開，陰離子氧自由基刺激了SOD合成來清除陰離子氧自由基，減少細(xì)胞膜的過氧化作用。隨著暴露時間的延長（6～9 d）， SOD活性因消耗而降低，或者SOD合成受到抑制。該研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果 [6，14]一致，即生物體暴露于污染環(huán)境后其SOD活性均出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制現(xiàn)象。這可能是因?yàn)殒溍顾貜U水中污染物在魚體內(nèi)累積，導(dǎo)致陰離子氧自由基在魚體內(nèi)累積速度加快，從而使SOD合成速度跟不上斑馬魚體內(nèi)陰離子氧自由基增加速度，抑制了SOD合成，也可能是SOD因消耗而活性降低，導(dǎo)致陰離子氧自由基的產(chǎn)生和消除平衡被破壞，機(jī)體細(xì)胞膜系統(tǒng)被氧化。暴露后期（12～15 d），SOD活性回到空白對照水平，可能是由于此時機(jī)體已對暴露物的逆境脅迫表現(xiàn)出了一定的耐受性，而且該污染脅迫沒有超出魚體耐受力，SOD再次被刺激，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，活性再度升高，說明魚體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)正在發(fā)揮作用，并且形成新的平衡。
3 2 生化法處理后的鏈霉素廢水出水對MDA含量影響
MDA作為氧化損傷最終形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量可間接反映機(jī)體自由基水平，是毒性作用、保護(hù)作用的綜合反映 [15]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)污染物進(jìn)入生物體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時，可形成大量活性氧自由基，這些活性氧自由基若不及時清除，就會引起DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶失活等損傷，對機(jī)體造成氧化脅迫 [16]。暴露初期（3 d），所有暴露組MDA含量較空白升高，這與SOD活性變化規(guī)律一致，說明斑馬魚在受到外界刺激時，MDA含量與SOD活性同時被激活，魚體通過產(chǎn)生MDA來清除陰離子氧自由基對生物體的迫害，說明此時斑馬魚已經(jīng)受到脂質(zhì)過氧化損傷。隨著暴露時間的延長，MDA含量存在一定程度的顯著誘導(dǎo)。暴露后期（9～15 d），MDA含量維持在對照水平，說明魚體消除了過多的陰離子氧自由基，達(dá)到了新的平衡，表明該污染脅迫仍在魚的承受范圍內(nèi)，這與沈洪艷等關(guān)于抗生素藥物環(huán)丙沙星對錦鯉抗氧化系統(tǒng)的毒性作用結(jié)果 [17]一致。隨著暴露時間延長與暴露濃度升高，SOD活性逐漸下降，與此同時，MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢 [18]。本試驗(yàn)中，30%試驗(yàn)組出現(xiàn)MDA含量低于對照組的情況，也有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象 [19-22]。本試驗(yàn)結(jié)果原因可能是隨著自由基的積累，雖然SOD活性下降，但是機(jī)體內(nèi)還存在其他酶被激活，清除過多陰離子氧自由基的作用，從而使魚體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)保持在穩(wěn)定狀態(tài)。endprint
斑馬魚暴露在生化法處理后的鏈霉素廢水出水中15 d，40%體積百分比試驗(yàn)組斑馬魚魚體SOD活性呈現(xiàn)出誘導(dǎo)—抑制—誘導(dǎo)—回落的趨勢，說明該試驗(yàn)組鏈霉素廢水出水能夠引起斑馬魚的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且15 d時機(jī)體已對鏈霉素廢水出水的逆境脅迫表現(xiàn)出了一定的耐受性。MDA含量均呈現(xiàn)誘導(dǎo)—回落的趨勢，說明經(jīng)過生化法處理后的10%、20%、30%、40%體積百分比鏈霉素廢水出水均能夠引起斑馬魚的脂質(zhì)氧化性損傷， 但是其污染脅迫水平在斑馬魚可以承受的范圍之內(nèi)。斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量在暴露過程中以誘導(dǎo)為主，表明經(jīng)過生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水比例達(dá)到10%時就可以對斑馬魚產(chǎn)生氧化損傷效應(yīng)，但是比例達(dá)到40%時其對斑馬魚的氧化損傷程度并未超過其抗氧化防御系統(tǒng)的閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)最終達(dá)到了新的平衡，說明魚體抗氧化防御系統(tǒng)具有自我調(diào)節(jié)功能。斑馬魚SOD活性、MDA含量均對鏈霉素生產(chǎn)廢水出水的脅迫有應(yīng)激反應(yīng)，兩者有協(xié)同性，但是SOD活性比MDA含量更敏感。
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趙月+曹志會+王冰等
摘要： 采用暴露試驗(yàn)方法，研究了10%、20%、30%、40%體積百分比的生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水15 d 內(nèi)對斑馬魚肌肉組織超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影響。結(jié)果顯示，斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量在暴露過程中以誘導(dǎo)為主，經(jīng)過生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水比例達(dá)到10%時就可以對斑馬魚產(chǎn)生氧化損傷效應(yīng)，但是比例達(dá)到40%時其對斑馬魚的氧化損傷程度并未超過其抗氧化防御系統(tǒng)的閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)最終達(dá)到了新的平衡，說明魚體抗氧化防御系統(tǒng)具有自我調(diào)節(jié)的功能。此外，斑馬魚SOD活性、MDA含量均對鏈霉素生產(chǎn)廢水的脅迫有應(yīng)激反應(yīng)，兩者有協(xié)同性，但是SOD活性比MDA含量更敏感。
關(guān)鍵詞： 鏈霉素；斑馬魚；抗氧化防御系統(tǒng)
中圖分類號： X703 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A
文章編號：1002-1302（2015）08-0348-03
隨著工業(yè)的發(fā)展，工業(yè)廢水排放對水生態(tài)系統(tǒng)、人類健康構(gòu)成了巨大威脅，同時給環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估和管理帶來了挑戰(zhàn) [1]。目前我國工業(yè)廢水排放的監(jiān)督管理以理化監(jiān)測為主，能快速定量測定某些廢水中的污染物含量，但對于組分復(fù)雜的工業(yè)廢水，難以用理化分析方法闡明其組分。因此，建議采用水生生物毒性試驗(yàn)來反映廢水的綜合毒性 [2-3]。制藥企業(yè)污水處理廠、城市污水處理廠的污水處理工藝對制藥廢水中的污染物質(zhì)去除仍不夠徹底 [4]。王麗萍等利用鯉魚、鯽魚對污水處理廠廢水的急性毒性進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，鯉魚對水質(zhì)毒性的敏感性高于鯽魚，出水對魚的毒性主要是由水中游離氨引起的 [5]。李麗君等用斑馬魚檢測幾家工業(yè)污染源廢水毒性，對各行業(yè)廢水的毒性、污水處理的效果以及污水的綜合毒性進(jìn)行了客觀評價，結(jié)果顯示，大部分行業(yè)的工業(yè)廢水經(jīng)處理后仍具有毒性 [4]。沈洪艷等采用暴露試驗(yàn)法研究了青霉素、土霉素混合廢水的出水不同暴露濃度對斑馬魚肌肉超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影響，結(jié)果表明，該廢水對斑馬魚機(jī)體造成了一定的氧化損傷 [6]。錦鯉長期暴露于鏈霉素廢水中會對其抗氧化防御系統(tǒng)及抗氧化能力產(chǎn)生影響 [7]。斑馬魚是國際標(biāo)準(zhǔn)組織推薦的試驗(yàn)用魚，斑馬魚成魚個體比其他魚種小，便于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，具有繁殖能力強(qiáng)、價格便宜等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于胚胎發(fā)育生物學(xué)研究、動物學(xué)基因表達(dá)研究、毒物在生物體內(nèi)殘留累積效應(yīng)研究、污染物對于魚類急性毒性研究等 [8-9]。本研究選取某大型鏈霉素生產(chǎn)企業(yè)污水處理廠生化法處理后的二沉池出水為水樣（以下簡稱鏈霉素廢水出水），以斑馬魚為研究對象，評估鏈霉素廢水出水對魚體肌肉組織SOD活性、MDA含量的影響，旨在為評價制藥工業(yè)廢水處理工藝有效性以及處理后出水的生態(tài)安全性提供依據(jù)。
1 材料與方法
1 1 儀器和試劑
UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）、DK-S26 型恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、TG16-WS 臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、JPBJ-608型便攜式溶解氧測定儀（上海精密科學(xué)與儀器有限公司）、EL204型電子分析天平（梅特勒-上海托利多有限公司）、FE20型pH計(jì)（梅特勒-上海托利多有限公司）、XK96-B型快速混勻器（姜堰新康醫(yī)療器械有限公司）、BBC-226STV海爾家用冰箱、SYZ-A型石英高純水蒸餾器（金壇市宏華儀器廠）、WAD-TH型硬度計(jì)、手動式勻漿器、溫度計(jì)、加熱棒、移液管等。試驗(yàn)用SOD、MDA、考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，醋酸、乙醇、生理鹽水均購自天津永大化學(xué)試劑公司。
1 2 受試生物
選用斑馬魚為受試生物，由河北省石家莊市水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供，體長為（34 05±0 43） mm，體質(zhì)量為（0 24±0 03） g， 魚苗經(jīng)5%食鹽水消毒后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，用 48 h 曝氣的脫氯自來水在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7 d用于試驗(yàn)，試驗(yàn)水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，馴養(yǎng)期間斑馬魚死亡率<4%。為防止餌料產(chǎn)生影響，試驗(yàn)前24 h停止喂食，整個急性試驗(yàn)期間不喂食。
1 3 方法
預(yù)試驗(yàn)：在27 cm×13 cm×15 cm的玻璃水族缸中每缸盛放4 L試液，分別設(shè)置8個預(yù)試驗(yàn)濃度組，鏈霉素出水體積百分比分別為：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。用曝氣48 h的除氯自來水進(jìn)行稀釋，水質(zhì)指標(biāo)滿足GB 11607—1989 《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》。每組隨機(jī)放入10尾魚，連續(xù)試驗(yàn) 96 h，每天更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)試驗(yàn)96 h后，并未觀察到任何1個試驗(yàn)組的斑馬魚全部死亡。急性毒性試驗(yàn)：根據(jù)上述預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行急性試驗(yàn)濃度設(shè)置，鏈霉素廢水出水選擇20%、40%、60%、80%、100%體積百分比來觀察鏈霉素廢水出水對斑馬魚造成的影響，每組10尾魚。亞急性毒性試驗(yàn)：對于鏈霉素廢水出水，設(shè)定亞急性毒性試驗(yàn)濃度為：10%、20%、30%、40%，研究不同暴露濃度鏈霉素廢水出水對斑馬魚的氧化損傷。試驗(yàn)設(shè)置1個空白組、4個試驗(yàn)組，每個試驗(yàn)組設(shè)置3個平行組。在5 L魚缸中分別放入4 L試驗(yàn)液，充分混合曝氣后將馴養(yǎng)的斑馬魚隨機(jī)放入各個試驗(yàn)組中，每組投放20尾魚，并進(jìn)行連續(xù)曝氣。亞急性毒性試驗(yàn)歷時 15 d，每天至少測定1次試驗(yàn)液中的溶解氧含量、pH值、硬度、水溫。采用靜態(tài)置換法，每天換水，分別于3、6、9、12、15 d測定斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量。
1 4 樣品處理
每次從相應(yīng)的試驗(yàn)組中取5尾試驗(yàn)魚，解剖，取其肌肉組織，在冰冷的0 86%生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量，放入玻璃勻漿管中；用移液器按1 ∶ 9（質(zhì)量體積比）取預(yù)冷的0 86%生理鹽水，加入勻漿管中進(jìn)行勻漿，在冰水浴中進(jìn)行勻漿，充分研磨約8 min，制得10%組織勻漿。將制備好的勻漿液用普通離心機(jī)在3 000 r/min下離心10 min，取其上清液保存于4 ℃冰箱中。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；采用硫代巴比妥酸反應(yīng)（TBA）比色法測定MDA含量。endprint
1 5 試驗(yàn)條件
試驗(yàn)所用廢水來自鏈霉素生產(chǎn)過程中的提煉工段，化學(xué)需氧量（COD）、生化需氧量（BOD5）、懸浮物、氨氮濃度分別為200、50、50、4 12 mg/L，色度為21。試驗(yàn)用水pH值約75，總硬度約100 mg/L，試驗(yàn)溫度為22～24 ℃，溶解氧含量不低于5 mg/L。試驗(yàn)期間用曝氣裝置連續(xù)曝氣，為了保證其濃度，每24 h換1次試驗(yàn)液，每天至少測定1次試驗(yàn)溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量。
1 6 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。
2 結(jié)果與分析
2 1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果
96 h內(nèi)，80%、100%濃度組斑馬魚出現(xiàn)側(cè)翻現(xiàn)象，游動十分遲緩。80%濃度組斑馬魚死亡4尾，100%濃度組斑馬魚死亡5尾。40%、60%濃度組斑馬魚游動緩慢，未出現(xiàn)側(cè)翻。20%濃度組斑馬魚行為未出現(xiàn)明顯異常。黃健等選用鏈霉素對6種海洋微藻進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，只有角毛藻、三角褐指藻在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)（0～500 mg/L）測到了72 h半抑制濃度，EC50分別為346、445 mg/L，其他4種海洋微藻均未測到72 h半抑制濃度 [10]。
2 2 亞急性毒性試驗(yàn)
2 2 1 生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水對斑馬魚肌肉SOD活性的影響 由圖1可知，3 d時，10%試驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)SOD活性比對照增加，但無顯著差異；20%、30%、40%試驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)SOD活性出現(xiàn)顯著性誘導(dǎo)作用，說明生化法處理后的鏈霉素廢水出水能夠引起斑馬魚氧化應(yīng)激反應(yīng)。斑馬魚通過升高SOD活性來抵御 O-2[KG- 2]· 對機(jī)體的侵害作用。6 d時，10%試驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)SOD活性比對照增加；20%、30%試驗(yàn)組則表現(xiàn)出抑制作用，但無顯著性差異；40%試驗(yàn)組表現(xiàn)出顯著抑制作用。這可能是因?yàn)殡S著暴露時間的延長，鏈霉素廢水中污染物在魚體內(nèi)不斷地累積，導(dǎo)致魚體內(nèi)產(chǎn)生大量O-2·，過多的O-2·消耗了SOD，也可能是過量的O-2·對魚體抗氧化酶產(chǎn)生了直接損傷，導(dǎo)致SOD活性降低。9 d時，10%試驗(yàn)組表現(xiàn)為對SOD活性有誘導(dǎo)作用但無顯著差異，其值略高于空白對照組；20%、30%、40%試驗(yàn)組均表現(xiàn)為抑制作用但無顯著性差異，其值略低于空白對照組。12 d時，10%、30%試驗(yàn)組表現(xiàn)出抑制作用但無顯著差異；20%試驗(yàn)組表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用但無顯著性差異；40%試驗(yàn)組表現(xiàn)出顯著誘導(dǎo)作用。15 d時，10%、40%試驗(yàn)組顯現(xiàn)出誘導(dǎo)作用但無顯著差異；20%、30%試驗(yàn)組表現(xiàn)出抑制作用但無顯著差異。綜上所述，生化法處理后的鏈霉素廢水出水比例為10%時對魚體影響是可逆的，并未超過其抗氧化防御系統(tǒng)閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)最終達(dá)到了新的平衡。
2 2 2 生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水對斑馬魚肌肉MDA含量的影響 如圖2所示，3 d時，10%、20%、30%、40%試驗(yàn)組斑馬魚肌肉MDA含量均表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，但是無顯著差異。6 d時，20%、30%試驗(yàn)組斑馬魚肌肉MDA含量均表現(xiàn)為顯著誘導(dǎo)作用。9 d時，30%試驗(yàn)組出現(xiàn)抑制作用但無顯著差異；10%、20%、40%試驗(yàn)組表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用但無顯著差異。試驗(yàn)后期（9～15 d），所有試驗(yàn)組MDA含量均與空白對照組無顯著差異。綜上所述，3 d時所有試驗(yàn)組斑馬魚肌肉MDA含量均表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，說明生化法處理后的鏈霉素廢水出水比例為10%時就已經(jīng)引起了魚體脂質(zhì)過氧化損傷；6 d時20%、30%試驗(yàn)組顯現(xiàn)出顯著誘導(dǎo)效果；9～15 d 時，10%、20%、40%試驗(yàn)組與空白對照組無顯著差異。本試驗(yàn)濃度范圍已經(jīng)引起了斑馬魚脂質(zhì)過氧化損傷，9～15 d時與空白對照組無顯著差異，說明斑馬魚抗氧化防御系統(tǒng)達(dá)到了新的平衡，該試驗(yàn)結(jié)果與SOD活性測定結(jié)果一致。
3 結(jié)論與討論
3 1 生化法處理后的鏈霉素廢水出水對SOD活性影響
SOD是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，主
要分布在胞漿和線粒體的基質(zhì)內(nèi) [11-13]，由于其是唯一1種以自由基為底物的抗氧化酶，因此在活性氧自由基清除方面中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，暴露初期（3 d），暴露組SOD活性較空白組升高，說明斑馬魚在受到外界刺激時，生物體內(nèi)陰離子氧自由基數(shù)量增多，SOD被激活，保護(hù)系統(tǒng)被打開，陰離子氧自由基刺激了SOD合成來清除陰離子氧自由基，減少細(xì)胞膜的過氧化作用。隨著暴露時間的延長（6～9 d）， SOD活性因消耗而降低，或者SOD合成受到抑制。該研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果 [6，14]一致，即生物體暴露于污染環(huán)境后其SOD活性均出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制現(xiàn)象。這可能是因?yàn)殒溍顾貜U水中污染物在魚體內(nèi)累積，導(dǎo)致陰離子氧自由基在魚體內(nèi)累積速度加快，從而使SOD合成速度跟不上斑馬魚體內(nèi)陰離子氧自由基增加速度，抑制了SOD合成，也可能是SOD因消耗而活性降低，導(dǎo)致陰離子氧自由基的產(chǎn)生和消除平衡被破壞，機(jī)體細(xì)胞膜系統(tǒng)被氧化。暴露后期（12～15 d），SOD活性回到空白對照水平，可能是由于此時機(jī)體已對暴露物的逆境脅迫表現(xiàn)出了一定的耐受性，而且該污染脅迫沒有超出魚體耐受力，SOD再次被刺激，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，活性再度升高，說明魚體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)正在發(fā)揮作用，并且形成新的平衡。
3 2 生化法處理后的鏈霉素廢水出水對MDA含量影響
MDA作為氧化損傷最終形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量可間接反映機(jī)體自由基水平，是毒性作用、保護(hù)作用的綜合反映 [15]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)污染物進(jìn)入生物體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時，可形成大量活性氧自由基，這些活性氧自由基若不及時清除，就會引起DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶失活等損傷，對機(jī)體造成氧化脅迫 [16]。暴露初期（3 d），所有暴露組MDA含量較空白升高，這與SOD活性變化規(guī)律一致，說明斑馬魚在受到外界刺激時，MDA含量與SOD活性同時被激活，魚體通過產(chǎn)生MDA來清除陰離子氧自由基對生物體的迫害，說明此時斑馬魚已經(jīng)受到脂質(zhì)過氧化損傷。隨著暴露時間的延長，MDA含量存在一定程度的顯著誘導(dǎo)。暴露后期（9～15 d），MDA含量維持在對照水平，說明魚體消除了過多的陰離子氧自由基，達(dá)到了新的平衡，表明該污染脅迫仍在魚的承受范圍內(nèi)，這與沈洪艷等關(guān)于抗生素藥物環(huán)丙沙星對錦鯉抗氧化系統(tǒng)的毒性作用結(jié)果 [17]一致。隨著暴露時間延長與暴露濃度升高，SOD活性逐漸下降，與此同時，MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢 [18]。本試驗(yàn)中，30%試驗(yàn)組出現(xiàn)MDA含量低于對照組的情況，也有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象 [19-22]。本試驗(yàn)結(jié)果原因可能是隨著自由基的積累，雖然SOD活性下降，但是機(jī)體內(nèi)還存在其他酶被激活，清除過多陰離子氧自由基的作用，從而使魚體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)保持在穩(wěn)定狀態(tài)。endprint
斑馬魚暴露在生化法處理后的鏈霉素廢水出水中15 d，40%體積百分比試驗(yàn)組斑馬魚魚體SOD活性呈現(xiàn)出誘導(dǎo)—抑制—誘導(dǎo)—回落的趨勢，說明該試驗(yàn)組鏈霉素廢水出水能夠引起斑馬魚的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且15 d時機(jī)體已對鏈霉素廢水出水的逆境脅迫表現(xiàn)出了一定的耐受性。MDA含量均呈現(xiàn)誘導(dǎo)—回落的趨勢，說明經(jīng)過生化法處理后的10%、20%、30%、40%體積百分比鏈霉素廢水出水均能夠引起斑馬魚的脂質(zhì)氧化性損傷， 但是其污染脅迫水平在斑馬魚可以承受的范圍之內(nèi)。斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量在暴露過程中以誘導(dǎo)為主，表明經(jīng)過生化法處理后的鏈霉素生產(chǎn)廢水出水比例達(dá)到10%時就可以對斑馬魚產(chǎn)生氧化損傷效應(yīng)，但是比例達(dá)到40%時其對斑馬魚的氧化損傷程度并未超過其抗氧化防御系統(tǒng)的閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)最終達(dá)到了新的平衡，說明魚體抗氧化防御系統(tǒng)具有自我調(diào)節(jié)功能。斑馬魚SOD活性、MDA含量均對鏈霉素生產(chǎn)廢水出水的脅迫有應(yīng)激反應(yīng)，兩者有協(xié)同性，但是SOD活性比MDA含量更敏感。
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