硫酸鈣鏈霉素的顆粒體外緩釋性能的研究

陳勇忠 衛(wèi)秀洋 翁少煌 劉永平

[摘要] 目的 了解載結(jié)核藥鏈霉素的硫酸鈣緩釋顆粒在體外的藥物緩釋性能。 方法 實(shí)驗(yàn)組，將鏈霉素與醫(yī)用硫酸鈣混合制備成載藥顆粒，將其置于模擬體液中，取1 d、2 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周、10周時(shí)緩沖液為樣本，高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)其中鏈霉素藥物的濃度，繪制藥物緩釋曲線?？瞻捉M，醫(yī)用硫酸鈣制備成未載藥顆粒。 結(jié)果 醫(yī)用硫酸鈣5 cc與鏈霉素1 g為最佳配比。載鏈霉素硫酸鈣顆粒在模擬體液中浸泡，緩釋顆粒3 d時(shí)累計(jì)釋放量15.33%。在8周前的樣本液中，藥物濃度均較高;至8周時(shí)鏈霉素的釋出濃度、仍達(dá)到的最小抑菌濃度，之后逐漸降低。未載鏈霉素的硫酸鈣顆粒在有效檢測(cè)時(shí)間內(nèi)藥物出峰時(shí)間處未見波峰出現(xiàn)。 結(jié)論 硫酸鈣鏈霉素顆粒具有效緩釋性能。8周內(nèi)模擬體液中釋出藥物的濃度均可達(dá)到抑制結(jié)核分枝桿菌的濃度。

[關(guān)鍵詞] 硫酸鈣;鏈霉素;緩釋;體外實(shí)驗(yàn)

[中圖分類號(hào)] R969? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）01-0040-04

Study on the sustained release properties of calcium sulfate streptomycin particles in vitro

CHEN Yongzhong1? ?WEI Xiuyang1? ?WENG Shaohuang2? ?LIU Yongping1

1.Department of Orthopaedics，476 Hospital of Fuzhou General Hospital，F(xiàn)uzhou? ?350002，China;2.College of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou? ?350002，China

[Abstract] Objective To understand the drug release properties of calcium sulfate sustained-release granules carrying the tuberculosis drug streptomycin in vitro. Methods In the experimental group， streptomycin was mixed with medical calcium sulfate to prepare drug-loaded granules， which were placed in simulated body fluids. The buffer at 1 day， 2 days， 3 days， 1 week， 2， 4 ， 6， 8 and 10 weeks was used as a sample. The concentration of streptomycin was detected by high performance liquid chromatography（HPLC）， and the drug sustained-release curve was drawn. In the blank group， medical calcium sulfate was prepared as unloaded particles. Results The medical calcium sulfate 5 cc and streptomycin 1g were the best ratio. The streptomycin calcium sulfate particles were soaked in the simulated body fluid， and the cumulative release of the sustained-release particles was 15.33%. In the sample solution before 8 weeks， the drug concentration was higher. Release concentration of streptomycin and still reached minimum inhibitory concentration at 8 weeks， and then gradually decreased. Calcium sulfate particles without streptomycin showed no peaks at the peak time of the drug during the effective detection time. Conclusion Calcium sulfate streptomycin granules have a slow release property. The concentration of the drug released in the simulated body fluid can reach the concentration of inhibiting tuberculosis within 8 weeks.

[Key words] Calcium sulfate; Streptomycin; Sustained release; In vitro experiments

脊柱是骨結(jié)核的好發(fā)部位之一，如果診治不及時(shí)或不規(guī)范，極易造成椎體破壞、甚至累及椎管，壓迫脊髓神經(jīng)，造成癱瘓[1-2]。椎體的上下終板主要由軟骨細(xì)胞、致密膠原及糖蛋白基質(zhì)共同構(gòu)成，自身修復(fù)困難。同時(shí)病灶周圍壞死硬化的骨具有屏障作用，導(dǎo)致局部藥物濃度過低或者不能達(dá)到病灶[3-4]。因此在治療脊柱結(jié)核的時(shí)候，不僅要規(guī)范的抗結(jié)核，維持局部有效血藥濃度，還要解決病灶填充、修復(fù)、成骨的問題。醫(yī)用硫酸鈣具有較好的抗壓縮強(qiáng)度、組織相容性、緩釋性能、成骨特性等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年研究的熱點(diǎn)[5-9]。同時(shí)我院已將硫酸鈣鏈霉素的顆粒已在臨床應(yīng)用，取得滿意效果[10-11]。但是硫酸鈣鏈霉素的顆粒緩釋性能如何尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將載鏈霉素的硫酸鈣顆粒浸泡在緩沖液中，在不同時(shí)間點(diǎn)取出緩沖液樣本中，采用高效液相色譜法（high perfromance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定藥物濃度，評(píng)價(jià)其在體外的緩釋性能。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料與試劑

注射用硫酸鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格1 g/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字H37020187）;醫(yī)用硫酸鈣（英國(guó)百賽公司，5 cc思迪骨粉，CS）;島津LC-15C型高效液相色譜儀（日本島津公司）;智能溶出實(shí)驗(yàn)儀（天大天發(fā)）。

1.2 不同規(guī)格的鏈霉素硫酸鈣緩釋系統(tǒng)的制作

不同規(guī)格的鏈霉素硫酸鈣，如下方法制作成顆粒。用萬能壓力測(cè)試機(jī)測(cè)試各個(gè)比例材料顆粒的抗壓強(qiáng)度和最大壓縮力，并測(cè)得最佳混合配比（1 g鏈霉素注射粉劑：5 cc醫(yī)用硫酸鈣粉劑）。

以1 g 鏈霉素注射粉劑與5 cc醫(yī)用硫酸鈣粉劑，后加入2 mL配套的混合液（滅菌注射用水），攪拌至糊狀，充填到模具中，10～15 min干硬后倒出便制成直徑3 mm、厚3 mm的含鏈霉素的硫酸鈣緩釋顆粒，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)。用同樣方法制備不混合任何藥硫酸鈣固化顆粒，進(jìn)行空白組實(shí)驗(yàn)。

1.3 緩釋液的采集

取16塊含鏈霉素的硫酸鈣緩釋顆粒，每塊材料分別置入40 mL經(jīng) 0.22 μm 濾器處理過的磷酸緩沖液（PBS，pH值7.3 5～7.40）模擬體液中，用生物半透膜包裹，避光放入37°C恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min 持續(xù)震蕩于整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期。每日取緩沖液5 mL，并回補(bǔ)PBS模擬體液5 mL。留取1 d、2 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周、10周各時(shí)間點(diǎn)緩沖液作為測(cè)定樣本，用0.22 μm濾器過濾后加入l mL的進(jìn)樣瓶中避光保存，備高效液相色譜儀檢測(cè)用。

1.4 緩釋液藥物濃度檢測(cè)

采用高效液相色譜儀對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)緩沖液樣本中鏈霉素的藥物濃度進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算單位時(shí)間段內(nèi)藥物的釋放度。色譜條件：CN（5 μm）、250 mm ×4.6 mm色譜柱;流動(dòng)相采用0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉（pH值3.0）：乙腈=50：50;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣體積10 μL。

利用HPLC 在上述色譜條件下檢測(cè)已知濃度的鏈霉素溶液，進(jìn)樣本檢測(cè)，通過測(cè)試設(shè)備軟件分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出鏈霉素藥物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。利用HPLC 在待檢測(cè)樣本，也在上述色譜條件下檢測(cè)，不同時(shí)間點(diǎn)樣本中鏈霉素對(duì)應(yīng)的曲線峰面積，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，換算得到各時(shí)間點(diǎn)緩沖液中藥物的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的比較，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硫酸鈣鏈霉素顆粒的制備及體外內(nèi)環(huán)境系統(tǒng)模型

硫酸鈣鏈霉素顆粒的制備過程及顆粒的配比是在預(yù)實(shí)驗(yàn)下多次制作，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。鏈霉素-硫酸鈣顆粒電子顯微鏡下顯示：結(jié)構(gòu)其中以棒狀結(jié)構(gòu)為主，硫酸鈣寬度為7.5 μm～10.0 μm，長(zhǎng)40.0 μm～50.0 μm，鏈霉素為顆粒形狀為主 5 μm×5 μm×5 μm。見圖1a～c。

2.2 硫酸鈣與鏈霉素顆粒的最佳混合比例

在緩釋顆粒中，當(dāng)鏈霉素與硫酸鈣在比例在小于5 cc：1 g時(shí)緩釋顆粒的抗壓強(qiáng)度及最大壓縮力，與單純硫酸鈣顆粒物無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)鏈霉素與硫酸鈣在比例在大于5 cc：1 g抗壓強(qiáng)度及最大壓縮力開始下降。因此本研究認(rèn)為緩釋顆粒鏈霉素與硫酸鈣在比例在大于5 cc：1g時(shí)為最佳配比。見表1。

2.2 硫酸鈣鏈霉素顆粒與非載藥硫酸鈣HPLC 色譜圖

硫酸鈣鏈霉素顆粒緩沖液的色譜圖顯示，7.36 min為鏈霉素的藥物峰。說明硫酸鈣鏈霉素顆粒能夠釋藥且能用HPLC法檢測(cè)到藥物濃度。未載藥硫酸鈣浸提液的色譜圖顯示，在7 min左右色譜圖的未出現(xiàn)明顯波峰，說明無藥物峰，未檢測(cè)到鏈霉素。見圖1e～g。

2.3 載藥人工材料體外緩釋藥物濃度

不同時(shí)間點(diǎn)浸提液中藥物濃度。在前8周各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的浸提液中藥物濃度均較高至8周時(shí)鏈霉素的釋出濃度均高于其10倍的最小抑菌濃度（MIC），之后逐漸降低。見表2。

2.4 載藥人工材料體外緩釋藥物釋放度

載鏈霉素硫酸鈣顆粒在模擬體液中浸泡，緩釋顆粒3 d時(shí)累計(jì)釋放量15.33%。1周、2周時(shí)釋放度分別為21.85%、62.31%?？梢娫?～2周時(shí)鏈霉素釋放較快，存在一定的“突釋”現(xiàn)象。之后逐漸平穩(wěn)釋放。在8周前的樣本液中，藥物濃度均較高;至8周時(shí)鏈霉素的釋出濃度、仍達(dá)到的最小抑菌濃度，之后逐漸降低。見表2。

3 討論

脊柱結(jié)核的治療主要在于解決抗結(jié)核化療、修復(fù)、脊柱穩(wěn)定性的問題。通過手術(shù)固定可以獲得脊柱穩(wěn)定問題。手術(shù)后如何抗結(jié)核與骨修復(fù)成為治療的熱點(diǎn)。抗結(jié)核藥物之一鏈霉素，臨床常常采用肌肉注射。連續(xù)肌肉注射長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，患者難以堅(jiān)持。若在清除結(jié)核病灶后直接在創(chuàng)面撒上鏈霉素粉劑，有效藥物濃度維持時(shí)間不夠長(zhǎng);如果病灶內(nèi)一次給予過量的藥物，但其不良反應(yīng)的發(fā)生率高。設(shè)計(jì)在病灶局部搭載含鏈霉素緩釋藥物人工骨支架植入是一種解決方案。本研究制備載了硫酸鈣鏈霉素緩釋顆粒，目的在于獲得一種新型材料植人病灶清除之后的缺損部位，兼具抗結(jié)核和修復(fù)骨缺損的雙重作用。硫酸鈣是一種理想的骨替代材料，植骨效果與自體骨相當(dāng)。廣泛應(yīng)用于口腔科和矯形外科[12-13]。選用其作為載體，可以修復(fù)病灶清除后的骨缺損。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理是利用智能溶出實(shí)驗(yàn)儀，體外模擬體內(nèi)環(huán)境，造出一個(gè)動(dòng)態(tài)的內(nèi)環(huán)境。將硫酸鈣鏈霉素緩釋顆粒在緩沖液內(nèi)，每日提取部分緩沖液體，作為測(cè)量樣本。同時(shí)補(bǔ)充緩沖液，模擬體內(nèi)的液體交換。通過高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定緩沖液，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定緩沖液體的藥物濃度，評(píng)價(jià)酸鈣鏈霉素顆粒在體外的緩釋性能。

設(shè)計(jì)模型基本可以模擬體內(nèi)環(huán)境。但是也存在局限性。體內(nèi)環(huán)境較復(fù)雜，顆粒鏈霉素在體內(nèi)不僅是代謝，吸收，還有傷口出血、滲出、引流丟失等。我們將每日提取緩沖液視為藥物在體內(nèi)的自然代謝。每次取樣后在補(bǔ)充回緩沖液，以求保持體液的平衡。

在緩釋顆粒中，硫酸鈣作為載體，主要提供緩釋效應(yīng)，同時(shí)硫酸鈣的量決定顆粒的硬度。顆粒的硬度又與顆粒的崩解時(shí)間正呈相關(guān)性。硫酸鈣份量越大，顆粒硬度越硬，崩解時(shí)間相對(duì)持久。鏈霉素提供抗結(jié)核藥物，鏈霉素總量決定局部藥物濃度。鏈霉素的份量又與局部濃度呈正相關(guān)。鏈霉素份量越大，局部藥物濃度相對(duì)較高。從顆粒力學(xué)性能結(jié)果顯示，當(dāng)鏈霉素與硫酸鈣在比例在小于1 g：5 cc時(shí)緩釋顆粒的抗壓強(qiáng)度及最大壓縮力，與單純硫酸鈣顆粒物無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)鏈霉素與硫酸鈣在比例在大于1 g：5 cc抗壓強(qiáng)度及最大壓縮力開始下降。要做到緩釋顆粒的持久緩釋性能，既要保證顆粒的硬度，又要兼顧顆粒載藥總量。因此我們認(rèn)為緩釋顆粒鏈霉素與硫酸鈣在比例在大于1 g：5 cc時(shí)為最佳配比。

從藥物緩釋曲線顯示，測(cè)定7周、8周時(shí)檢測(cè)液中，鏈霉素的濃度9.01 μg/mL，0.07 μg/mL。鏈霉素的MIC為0.05 μg/mL。文獻(xiàn)報(bào)道抗結(jié)核藥物一般最低殺菌濃度MBC為最低抑菌濃度MIC的10倍[14]。所以在將近2個(gè)月內(nèi)均能在最低殺菌濃度范圍內(nèi)?？梢娏蛩徕}鏈霉素緩釋顆粒這種緩釋作用在抗結(jié)核療程中具有重要臨床意義的。

從繪制的藥物釋放度曲線顯示，3 d、1周、2周時(shí)釋放度分別15.33%、21.85%、62.31%?？梢娫?～2周時(shí)鏈霉素釋放較快，存在一定的“突釋”現(xiàn)象。之后藥物釋放度曲線逐漸平穩(wěn)釋放。藥物的突釋也是藥物工作者共同存在的問題。突釋效應(yīng)一般出現(xiàn)在藥物釋放的最初階段，在短時(shí)間內(nèi)釋放出大量的藥物，產(chǎn)生全身不良反應(yīng)。對(duì)于靶向緩釋載體而言，這將導(dǎo)致靶部位有效藥物質(zhì)量的減少，最終削弱緩釋載體的靶向作用。資料顯示[15-16]，藥物突釋的定義3 d內(nèi)釋放量比例不超過總量的40%。本緩釋顆粒3 d時(shí)累計(jì)釋放量15.33%，在藥物突釋的范圍內(nèi)。從實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示，顆粒在緩沖液體內(nèi)浸泡，在1～2周時(shí)出現(xiàn)崩解，顆粒碎裂，崩解后出現(xiàn)大量的小顆粒，小顆粒表面的鏈霉素大量釋放，存在突釋。之后曲線相對(duì)平穩(wěn)，是由于顆粒在制作的過程中，通過加壓，干燥過程，硫酸鈣的棒狀結(jié)構(gòu)和鏈霉素分子之間產(chǎn)生螯合作用，相互結(jié)合。雖然大顆粒遇水出現(xiàn)崩解，但是硫酸鈣和鏈霉素小分子之間的螯合作用，硫酸鈣分子逐漸釋放出鏈霉素。同時(shí)顆粒在電鏡下結(jié)構(gòu)也顯示，鏈霉素與硫酸鈣棒狀的分子結(jié)構(gòu)，分子間相互交錯(cuò)成形，能夠起到的緩慢釋放作用的基礎(chǔ)。

2005版《中國(guó)藥典》規(guī)定體外藥物釋放開始0.5 h內(nèi)的釋放量應(yīng)小于40%，對(duì)于安全性差的藥物更應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格控制，相關(guān)文獻(xiàn)也有諸多報(bào)到[17]。出于臨床用藥對(duì)人體絕對(duì)安全性的考慮，該鈣鏈霉素緩釋顆?？偹幜啃∮诿咳张R床口服與靜脈滴注的用藥量，且藥物是在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以相對(duì)穩(wěn)定的速率釋放的，保證單位時(shí)間內(nèi)藥物釋放量處于安全范圍內(nèi)。

研究表明硫酸鈣鏈霉素顆粒具有效緩釋性能，模擬體液中釋出藥物的濃度可長(zhǎng)期達(dá)到殺死結(jié)核分枝桿菌的濃度。課題也存在局限性，該顆粒的釋放制作過程進(jìn)一步優(yōu)化，顆粒的配比需進(jìn)一步細(xì)化，體外模擬裝備不能完全等同體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將后續(xù)報(bào)道。

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