戊二醛交聯(lián)的傳感器檢測(cè)布魯氏菌抗體的研究

楊威，韓小平，張志勇，左月明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，山西 太谷 030801)

布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏菌感染引起的人畜共患傳染病[1,2]。動(dòng)物感染后臨床主要表現(xiàn)為母畜流產(chǎn)、乳腺炎和不育等[3]，接觸布魯氏菌感染的病畜或畜產(chǎn)品可使人類患病，病程持續(xù)時(shí)間較長，嚴(yán)重的可致殘，喪失勞動(dòng)能力[4]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失，帶來嚴(yán)重的公共健康問題[5]。因此，建立一種能夠早期簡便、快速檢測(cè)布病的方法很有必要。布病的傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在操作繁瑣、耗時(shí)、檢測(cè)靈敏度低等缺點(diǎn)[6]。近年來，基于電化學(xué)原理的免疫傳感器迅速發(fā)展，在生物技術(shù)、臨床診斷及快速檢測(cè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[7]，其主要原理是利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性，通過測(cè)試與待測(cè)物濃度相關(guān)的電流信號(hào)實(shí)現(xiàn)待測(cè)物濃度的定量檢測(cè)。相對(duì)于檢測(cè)布病的傳統(tǒng)方法，電化學(xué)免疫傳感器具有響應(yīng)快、靈敏度高和檢測(cè)限低等特點(diǎn)[8]。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測(cè)低濃度抗體，對(duì)早期診斷布病具有重要意義。

戊二醛是常用的交聯(lián)劑，其分子末端有兩個(gè)醛基基團(tuán)，能和酶或蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生反應(yīng)[9]。陳敏等[10]構(gòu)建了靈敏的鐵氰化鉀/殼聚糖/戊二醛信號(hào)體系，建立了無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器用于血清中癌胚抗原檢測(cè)。超聲破碎細(xì)胞是利用超聲波在液體中產(chǎn)生空化效應(yīng)，使細(xì)胞(細(xì)菌)破裂[11]。處理后的菌懸液粘度降低，同時(shí)促進(jìn)了菌體分散，操作簡單，樣品損失少。陳善真等[12]利用克隆表達(dá)的蛋白做抗原和超聲破碎抗原建立檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的 ELISA 方法，同時(shí)檢測(cè)了 78 份血清樣品，結(jié)果表明后者有更高的檢出率。本試驗(yàn)對(duì)布魯氏菌抗原進(jìn)行超聲處理，以改善抗原綁定到電極上的效率和結(jié)合抗體的效率。

本文通過戊二醛交聯(lián)將布魯氏菌抗原或超聲破碎后的布魯氏菌抗原固定到預(yù)處理后的絲網(wǎng)印刷金電極表面，根據(jù)抗原抗體的免疫反應(yīng)原理，檢測(cè)不同濃度的布魯氏菌抗體，建立峰電流的變化量與抗體濃度之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)低濃度布魯氏菌抗體的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(抗體)和布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；巰基乙胺(Cysteamine，CA)和25%戊二醛(Glutaraldehyde，GA)購于西格瑪奧德里奇公司；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)購自羅氏公司；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、亞鐵氰化鉀(K4[Fe(CN)6])、氯化鈉(NaCl)、無水乙醇(C2H6O)、氯化鉀(KCl)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；配置溶液使用超純水(18.2 M·cm)。

超純水機(jī)(NW30VM型，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY99-ⅡDN型，寧波新芝生物科技有限公司)；絲網(wǎng)印刷金電極(SPGE)(X250BT型，西班牙DropSens公司)；測(cè)試過程在上海辰華公司的電化學(xué)工作站(CHI760C型)上完成。

1.2 溶液配制

磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)：稱量磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉加入超純水配成10 mmol·L-1的溶液后，加入0.9 %的氯化鈉溶液，然后將溶液的pH值調(diào)整至7.4，經(jīng)高溫高壓滅菌后，制備成10 mmol·L-1、pH7.4的磷酸鹽緩沖液，于4 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆茫４鏁r(shí)間不超過2周。

電解液：稱取0.164 6 g的鐵氰化鉀、0.211 2 g亞鐵氰化鉀和1.491 0 g氯化鉀溶解到10 mmol·L-1的PBS中，定容到200 mL，得到5 mmol·L-1的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀([Fe(CN)6]3-/4-)電解液。

牛血清白蛋白溶液(Bovine Serum Albumin，BSA)：1% BSA/PBS溶液，使用時(shí)配制。

戊二醛溶液(Glutaraldehyde，GA)：2.5%的GA/PBS溶液，使用時(shí)配制。

1.3 布魯氏菌抗原、抗體的準(zhǔn)備

布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(抗體)用PBS梯度稀釋成濃度為1×10-5、1×10-3、1×10-1、1×10、1×102IU·mL-1的溶液。布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原配置成4×109CFU·mL-1的溶液。

1.4 超聲破碎抗原的制備

取1 mL布魯氏菌抗原液，用PBS配置50 mL的菌懸液，將稀釋的菌懸液放入100 mL燒杯中，為了避免產(chǎn)生高溫，超聲破碎在冰浴中進(jìn)行。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)參數(shù)設(shè)置：功率480 W，工作2 s，間隔5 s，全程工作15 min。將經(jīng)過超聲波作用的抗原液在4 500 r·min-1的條件下離心15 min，棄掉上層液體，取沉淀，PBS重懸，棄掉上層液體，將抗原溶液4 ℃環(huán)境保存[13]。

1.5 電極預(yù)處理

將絲網(wǎng)印刷金電極在-0.10～1.50 V的電壓范圍內(nèi)，以0.1 V·s-1的掃速在0.5 mol·L-1硫酸中采用循環(huán)伏安法掃描8次，預(yù)處理后的金電極用超純水清洗干凈。

1.6 測(cè)試方法

免疫傳感器測(cè)試采用3種方法。循環(huán)伏安法(Cyclic Voltammetry，CV)測(cè)試的基本參數(shù)：在-0.30～0.60 V的電壓范圍內(nèi)，0.1 V·s-1的速率條件下進(jìn)行掃描。差分脈沖伏安法(Differential Pulse Voltammetry，DPV)測(cè)試的基本參數(shù)：電壓范圍為-0.15～0.35 V，電壓增量為0.004 V，振幅0.05 V，脈沖寬度0.06 s，采樣寬度0.02 s，脈沖周期0.2 s。方波伏安法(Square Wave Voltammetry，SWV)測(cè)試的基本參數(shù)：電壓范圍為-0.10～0.40 V，電位增量為0.004 V，振幅0.025 V，頻率15 Hz。免疫傳感器上依次結(jié)合不同濃度梯度的抗體測(cè)試[14]，以[Fe(CN)6]3-/4-為支持電解液的室溫下完成[15]。數(shù)據(jù)分析采用origin8.5軟件。

1.7 免疫傳感器的制備

1.7.1 戊二醛交聯(lián)法制備免疫傳感器

將2.5 %戊二醛溶液滴涂到預(yù)處理后的工作電極表面，37 ℃恒溫濕盒中孵育1 h取出，用PBS和超純水分別充分清洗2次，室溫晾干，以去除未結(jié)合的戊二醛。吸取10 μL濃度為4×109CFU·mL-1的抗原溶液滴涂于修飾后的工作電極，在37 ℃恒溫濕盒中靜置2 h，取出，用緩沖液和超純水清洗，以除去沒有結(jié)合的抗原。電極表面涂覆1 % 的BSA溶液于37 ℃濕盒中反應(yīng)1 h，以封閉非特異性吸附位點(diǎn)，用緩沖液和超純水沖洗2次，將未結(jié)合的BSA清洗干凈，制備好的免疫傳感器靜置在4 ℃環(huán)境中。

1.7.2 綁定超聲破碎抗原的免疫傳感器制備

免疫傳感器A：用50 μL濃度為10 mmol·L-1的CA修飾經(jīng)過預(yù)處理的SPGE，放置于室溫密閉環(huán)境中反應(yīng)2 h，然后分別用乙醇和超純水清洗干凈，以去除未結(jié)合的CA。在電極表面結(jié)合10 μL的2.5 % GA，37 ℃環(huán)境中反應(yīng)1 h，再用緩沖液和超純水清洗干凈，以除去未偶聯(lián)的GA。取10 μL超聲波處理的抗原液，滴于修飾后的工作電極表面，37 ℃濕盒中孵育1 h，取出清洗，晾干。再封閉非特異性位點(diǎn)(同1.7.1封閉過程)。保存制備好的免疫傳感器。

免疫傳感器B：將2.5 %GA滴涂到預(yù)處理后的SPGE上，37 ℃恒溫濕盒中反應(yīng)1 h取出，用PBS和超純水分別清洗2次，以除去未結(jié)合的GA。吸取10 μL超聲波處理的抗原液，滴涂于修飾后的工作電極表面，37 ℃恒溫濕盒中孵育1 h取出，用PBS和超純水清洗室溫晾干。再封閉非特異性位點(diǎn)(同1.7.1封閉過程)。

免疫傳感器C：將預(yù)處理后的金電極用超純水清洗干凈。吸取10 μL超聲波處理的抗原液，涂于預(yù)處理后的SPGE的工作電極上，37 ℃孵育1 h，取出后清洗2次。再封閉非特異性位點(diǎn)(同1.7.1封閉過程)。將制備好的免疫電極保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 戊二醛交聯(lián)法制備免疫傳感器的伏安特性響應(yīng)

通過戊二醛交聯(lián)法將布魯氏菌抗原直接綁定在預(yù)處理后的工作電極表面，蛋白質(zhì)分子以共價(jià)鍵結(jié)合的方式與固相載體連接[16]。之后再綁定布魯氏菌抗原，每次滴加不同濃度的待測(cè)抗體到免疫傳感器工作電極表面后孵育30 min。根據(jù)免疫反應(yīng)原理，布魯氏菌抗原將布魯氏菌抗體捕獲到電極表面，分別采用CV、DPV和SWV三種方法檢測(cè)。隨著待測(cè)抗體濃度的增大，測(cè)試后的氧化峰電流響應(yīng)值逐漸減小，表明抗原和抗體形成的免疫復(fù)合物阻斷了氧化還原探針向電極表面的轉(zhuǎn)移。隨著結(jié)合抗體濃度的逐漸增大，傳導(dǎo)的阻礙也進(jìn)一步增加，導(dǎo)致峰電流值降低，如圖1所示。

圖1 免疫傳感器的伏安曲線Fig.1 Votammetry behavior of the immunosensor

布魯氏菌抗體濃度范圍在1×10-5～1×10 IU·mL-1內(nèi)，伏安法測(cè)定的電流變化量與抗體濃度對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，如表1所示(n=3)。通過CV法測(cè)試后(如圖2a所示)，擬合曲線能夠較好的區(qū)分1×10-5、1×10-3、1×10-1、1×10 IU·mL-14個(gè)濃度的待測(cè)抗體溶液，標(biāo)準(zhǔn)偏差最小，有較好的重現(xiàn)性，但是在3種測(cè)試方法中靈敏度最低。DPV方法測(cè)試后(如圖2b所示)，免疫傳感器能夠較好的區(qū)分1×10-5、1×10-3、1×10-1IU·mL-13個(gè)濃度梯度的待測(cè)抗體溶液，曲線不能很好的區(qū)分1×10、1×10-1IU·mL-1濃度的待測(cè)抗體溶液。從圖2c可以看出，SWV方法測(cè)試后，免疫傳感器能區(qū)分1×10-5、1×10-3IU·mL-1兩個(gè)濃度梯度的待測(cè)抗體溶液，其他3個(gè)濃度梯度的抗體溶液數(shù)據(jù)有重疊，不能區(qū)分。在3種測(cè)試方法中，SWV方法得到擬合函數(shù)的靈敏度最高(6.886 2)，檢測(cè)限為1.206 5×10-9IU·mL-1，但標(biāo)準(zhǔn)偏差比CV、DPV方法得到的數(shù)值大。

2.2 免疫傳感器固定超聲破碎抗原測(cè)試抗體的響應(yīng)

3種類型電極分別綁定超聲破碎抗原后的特征參數(shù)，如表2所示，采用CV方法測(cè)試，其免疫傳感器A的峰電流值最大(105.48±10.22 μA)，有利于提高免疫傳感器的靈敏度，有潛力滿足多個(gè)濃度梯度的測(cè)試要求。免疫傳感器C的峰電流值最小(50.37±6.26 μA)，作為電流型免疫傳感器沒有明顯優(yōu)勢(shì)。

考察A、B和C三種免疫傳感器在綁定經(jīng)超聲處理抗原的峰電流值的凈增量，如表3所示。免疫傳感器A峰電流的凈增量最小，為5.97 μA，免疫傳感器C峰電流的凈增量最大，為61.09 μA，表明電極經(jīng)過不同步驟處理和修飾后，綁定超聲破碎處 理的抗原的量不同。將A、B、C三種類型的免疫傳感器分別依次綁定濃度為1×10-5、1×10-3、1×10-1、1×10、1×102IU·mL-1的抗體溶液，免疫傳感器A在抗體濃度1×10-5IU·mL-1到1×102IU·mL-1范圍內(nèi)，峰電流值與抗體對(duì)數(shù)濃度呈正比，能連續(xù)測(cè)試5個(gè)濃度梯度的抗體溶液。免疫傳感器B在抗體濃度1×10-5～1×10 IU·mL-1時(shí)，峰電流值與抗體對(duì)數(shù)濃度呈正比關(guān)系，能連續(xù)測(cè)試4個(gè)濃度梯度的抗體溶液。免疫傳感器C在抗體濃度1×10-5～1×10-1IU·mL-1時(shí)，峰電流值與抗體對(duì)數(shù)濃度呈正比關(guān)系，能夠連續(xù)測(cè)試3個(gè)濃度梯度的抗體溶液。圖3所示，A、B、C 3種類型免疫傳感器測(cè)試不同濃度抗體溶液后的靈敏度依次降低，能夠檢測(cè)的抗體濃度梯度依次減少。可能由于電極表面結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致綁定抗原的量存在差異，影響抗原抗體免疫復(fù)合物的形成。3種類型免疫傳感器的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。

表1 不同測(cè)試方法免疫傳感器的參數(shù)比較Table 1 Comparison of parameters of immunosensor with different testing methods

表2 電極的特征參數(shù)Table 2 Characteristic parameters for the electrode

表3 電極的特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters for the electrode

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用預(yù)處理后的絲網(wǎng)印刷金電極修飾戊二醛綁定布魯氏菌抗原制備了免疫傳感器，采用CV、DPV和SWV 3種檢測(cè)方法，分別對(duì)檢測(cè)不同濃度布魯氏菌抗體的情況進(jìn)行表征。其中，SWV方法測(cè)試后的檢測(cè)限最低，靈敏度最高。采用戊二醛偶聯(lián)方法能有效將抗原固定到絲網(wǎng)印刷金電極表面，檢測(cè)低濃度抗體。在修飾后的金電極上綁定未經(jīng)超聲破碎處理的抗原比綁定經(jīng)超聲破碎處理的抗原測(cè)試效果好。2種方式檢測(cè)低濃度的布魯氏菌抗體是可行的，但綁定超聲破碎抗原的方式需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究減小誤差。本試驗(yàn)可以為其他致病菌的檢測(cè)研究提供參考。

圖3 電流變化量與抗體濃度對(duì)數(shù)的關(guān)系Fig.3 The relationship between the variation of current and the logarithm of antibody concentration

參 考 文 獻(xiàn)

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