糜子Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因的序列特征及表達(dá)分析

何杰麗，薛延桃，王瑞云,*，陳國榮，陳凌，王海崗，楊美紅*，喬治軍*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031)

糜子(PanicummiliaceumL.)，屬禾本科黍?qū)?，抗逆性?qiáng)，是干旱半干旱地區(qū)主糧作物[1、2]。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是植物基因組中普遍存在的一類遺傳因子，以DNA-RNA-DNA的轉(zhuǎn)座機(jī)制在植物基因組中移動，從而影響基因組變化和基因表達(dá)[3]。根據(jù)功能不同植物中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子包括兩大類，長末端重復(fù)序列(LTRs，long terminal repeats)和非長末端重復(fù)序列(non-LTRs，no-long terminal repeats)[4]。Non-LTR包括PLE類型(PLE)、DIRS類型(DIRS)、短散布重復(fù)序列(SINE，short interspersed repetitive element)以及長散布重復(fù)序列(LINE，long interspersed repetitive element)[5]；LTR包括Ty1-copia和Ty3-gypsy兩種類型[6]，含3個基因，分別為聚合酶基因(pol)、特異抗原基因(gag)、整合酶基因(int)。Ty1-copia和Ty3-gypsy兩類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和功能相似，主要區(qū)別為pol基因區(qū)域中INT基因插入的位置不同。一般情況下反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子由于缺失、移框和終止子等原因，不能形成反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白，不具生物學(xué)活性，呈靜止?fàn)顟B(tài)。病毒、細(xì)菌、真菌病原接種[7～9]以及水楊酸、茉莉酸甲酯[10]等生物和非生物脅迫后，不活躍的LTR在植物受到轉(zhuǎn)錄激活。在生物和非生物脅迫下，植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子被激活以參與調(diào)節(jié)抗逆相關(guān)基因表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的發(fā)生可能與植物自我防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)，是植物保護(hù)自我的反應(yīng)機(jī)制[11]。

糜子中參與干旱脅迫應(yīng)答的相關(guān)基因有很多[12～14]，但關(guān)于糜子Ty1-copia基因是否參與干旱脅迫應(yīng)答、其表達(dá)特性如何尚未見報道。本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了Ty1-copia編碼蛋白的生化特性，用qRT-PCR對其在植株葉片不同脅迫時間處理后目標(biāo)基因的表達(dá)水平做了分析。旨在為利用Ty1-copia基因改良作物抗旱性及分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為黃糜子(00005272)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供。前期轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)糜子cDNA文庫中的一段DNA序列，根據(jù)Swissprot、nr、nt三個數(shù)據(jù)庫注釋可知該序列所編碼的蛋白是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白。該基因表達(dá)分析的材料培養(yǎng)方法同王瑞云[12]，利用20% PEG-6000蒸餾水溶液進(jìn)行干旱脅迫處理，分別于處理后0、3、6和8 h取樣。

1.2 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

在NCBI中，用ORF Finder在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/)預(yù)測開放閱讀框并翻譯蛋白質(zhì)序列；用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；用SignalP2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析軟件對蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測；用YinOYang 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/)在線軟件預(yù)測蛋白的葡萄糖-O糖基化位點；用NetNES(http://www.cbs.dtu.dk)在線軟件分析該蛋白有無核輸出信號；用TargetP(http://www. cbs.dtu.dk /services/TargetP)、ChloroP(http:// www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP)在線軟件對該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)在線程序?qū)Ψ崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件對該蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；用DNAMAN(version 8.0) 和MEGA(version 7.0.21進(jìn)行序列多重比較并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/)預(yù)測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的保守結(jié)構(gòu)。

1.3 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因的實時熒光定量表達(dá)分析

采用TRIzon總RNA提取試劑盒(CW0580S)提取葉片總黃糜子葉片RNA，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。采用PrimeScript? RT Master Mix試劑盒(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，保存于-20 ℃ 冰箱。用Primer5軟件設(shè)計特異引物(F：5'- CTCAGTCAGCGAGGTTAT -3'，R：5'-ACGAGAACAGACCATAGC-3')與內(nèi)參引物ACT(F：ACCGAAGCCCCTCTTAACCC，R：5'-GTATGGCTGACACCATCACC-3')[15]并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以 cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL，包括模板(糜子cDNA)1 μL，SYBR Premix EX Taq II (Tli RnaseH Plus)(2×) 5 μL，50×ROX 0.2 μL，前后引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，39個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實時定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，利用2-△△CT法[16]計算基因在不同樣品中的相對表達(dá)量。不同樣品間差異顯著性用DPS軟件中的one-way ANOVA中的Duncan多重比較進(jìn)行統(tǒng)計分析每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的cDNA序列包含285 bp的完整開放閱讀框，編碼94個氨基酸，5’端有一個起始密碼子ATG，編碼甲硫氨酸(M)，3’端有一個終止密碼子ATT，不編碼氨基酸(圖1)。該蛋白的理化性質(zhì)(表1)，是由19種氨基酸組成(色氨酸含量為0)，其中亮氨酸(L)和絲氨酸(S)含量較高，分別為10.6%和11.7%；谷氨酰胺(Q)、組氨酸(H)和蘇氨酸(T)3種氨基酸含量較少，均為1.1%；帶8個負(fù)電荷氨基酸，帶12個正電荷氨基酸，說明該蛋白總體呈弱堿性；不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性、脂肪系數(shù)說明該蛋白是不穩(wěn)定的疏水蛋白。

表1 Ty1-copia蛋白的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of Ty1-copia protein

圖1 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and predicted amino acid sequences of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.2 信號肽預(yù)測

SignalP2.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白信號肽序列，結(jié)果顯示信號肽可能性為0.00，信號錨序列可能性為0.049，最大切割位點可能性為0.00(圖2)，說明該蛋白無信號肽，可能是非分泌型蛋白，在細(xì)胞膜內(nèi)表達(dá)。

圖2 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的信號肽預(yù)測Fig.2 Signal peptide prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.3 葡萄糖-O糖基化位點的預(yù)測

YinOYang 1.2在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/)預(yù)測Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的葡萄糖-O糖基化位點，結(jié)果顯示該蛋白有四個葡萄糖-O-糖基化位點，分別為48位的絲氨酸(S)、78位的絲氨酸(S)、93位的絲氨酸(S)和94位的絲氨酸(S)，其中48位和78位的絲氨酸是葡萄糖-O糖基化位點的可能性較大(圖3)。糖基化位點與細(xì)胞的信號通路有著密切聯(lián)系，所以進(jìn)一步說明該蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

圖3 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的葡萄糖-O-糖基化位點預(yù)測Fig.3 Glucose-O-glycosylation site prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.4 核輸出信號分析

NetNES(http://www.cbs.dtu.dk)在線軟件分析Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白有無核輸出信號，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)的第13位的纈氨酸(V)和第15位的異亮氨酸(I)的NES-Score均超過閾值(圖4)，該氨基酸即為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的核輸出信號，表明該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖4 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的核定位信號預(yù)測Fig.4 Nuclear localization signal prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.5 亞細(xì)胞定位

ChloroP(http:// www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP)和TargetP(http://www. cbs.dtu.dk /services/TargetP)在線軟件對Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該蛋白葉綠體靶向肽(cTP)值為0.439，mTP(線粒體靶向肽)值為0.185(圖5)，cTP和mTP值均太低，說明該蛋白質(zhì)不能定位于葉綠體和線粒體上。

圖5 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.6 跨膜螺旋預(yù)測

TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件對Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖6)；有一段跨膜肽鏈(46位氨基酸到63位氨基酸的肽鏈)，且N-末端在膜外，C-末端在膜內(nèi)(圖7)。

圖6 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Transmembrane helix structure prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

圖7 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的跨膜肽鏈Fig.7 Transmembrane peptide chain of Ty1-copia type retrotransposon

2.7 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

Phyre2在線程序(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)預(yù)測Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白包含4個α螺旋和4個β折疊，α螺旋占38%，β 折疊占31%(圖8)，α螺旋的區(qū)域明顯大于β折疊的區(qū)域，說明α螺旋是該蛋白的大量結(jié)構(gòu)元件；三維結(jié)構(gòu)中紅色表示N端，藍(lán)色表示C端，其中有一個明顯的螺旋結(jié)構(gòu)和兩個明顯的折疊結(jié)構(gòu)(圖9)。

2.8 保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

MEME(http://meme-suite.org/)在線軟件預(yù)測Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白有4個保守結(jié)構(gòu)域，分別是3至8位的5’-NLGAAK-3’、28至33位的5’-QRGYIE-3’、40至45位的5’-NMHDAK-3‘以及81至86位的5’-VDCLMY-3’(圖10)。在與水稻、毛竹、辣椒等其他8種作物的多重序列比對中也找到了相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)(圖11)。

圖8 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure of Ty1-copia type retrotransposon protein

圖9 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.9 Tertiary structure of Ty1-copia type retrotransposon protein

圖10 Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.10 Conservative domain prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.9 多重序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

用DNAMAN(version 8.0) 軟件對該蛋白的同源序列進(jìn)行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖11、12)。多重序列比對結(jié)果顯示各個物種Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的氨基酸差異較大，相似性只有24.9%，說明該蛋白的保守性不強(qiáng)，在進(jìn)化過程中發(fā)生突變的可能性較大。進(jìn)化樹結(jié)果顯示糜子的Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白與稻屬(粳稻、野生稻、藥用稻)和毛竹序列一致性為64%。

圖11 9種植物Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的氨基酸多重序列比對Fig.11 Amino acid multiple sequence comparison of Ty1 - copia type retroviruses of nine plants注：* 表示保守結(jié)構(gòu)。Note: * represents a conservative structure.

圖12 9種植物Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的進(jìn)化樹Fig.12 Evolutionary tree of Ty1-copia type retrotransposon protein of 9 species

2.10 糜子Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因的表達(dá)特性分析

qRT-PCR 分析表明，Ty1-copia表達(dá)水平在干旱脅迫處理不同時間點存在顯著差異(表2)。3 h時表達(dá)量最高，為對照的2.02倍；8 h時該基因呈下調(diào)表達(dá)，表達(dá)量低于對照，說明該基因可以響應(yīng)干旱脅迫誘導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

植物抗逆反應(yīng)是植物的一種自我保護(hù)，該過程是比較復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，Ty1-copia基因編碼轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Ty1-copia基因編碼蛋白在某些生物和非生物脅迫下表達(dá)，從而激活植物抗逆相關(guān)基因表達(dá)，提高植物的抗逆性[17]。根據(jù)Tnt1[7]和Tto1[18]以及OARE-1[11]通過物理(紫外照射和傷害)以及化學(xué)(尤其是水楊酸)脅迫被激活，發(fā)現(xiàn)Ty1-copia基因的表達(dá)和植物的抗逆性密切相關(guān)。我們用PEG模擬干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)處理3 h時基因表達(dá)量是對照的2.02倍，8 h時則呈下調(diào)表達(dá)，說明Ty1-copia基因可能參與糜子的抗旱性響應(yīng)。

表2 Ty1-copia 基因表達(dá)水平Table 2 Expression level of Ty1-copiagene

注：不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。
Note: Different captial and lowercase letters indicate extremely remarkable and significant difference at 0.01 and 0.05 level, respectively.

江樹業(yè)等[19]以籽粒莧為材料，克隆并研究了Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在籽粒莧中的作用，結(jié)果表明在28條克隆序列中存在高度的異質(zhì)性。周鵬等[20]以梨為材料研究結(jié)果類似，克隆的32條序列中也存在異質(zhì)性，并且發(fā)現(xiàn)堿基的替換、缺失、易位導(dǎo)致的突變是其具有異質(zhì)性的重要原因之一，說明了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化過程中保守性不高。本研究也對Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的序列特征分析，通過同源性比對，該基因?qū)儆赗VT-2超家族成員，糜子Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白與大部分單子葉植物聚為一類，相反，與雙子葉植物的氨基酸的一致性較低，可見雙子葉植物和單子葉植物在Ty1-copia型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的遺傳進(jìn)化上存在較大差異，進(jìn)化過程中保守性不高。

目前本實驗室已對糜子種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了初步評估[21～23]，后續(xù)研究將側(cè)重于挖掘和克隆糜子抗旱相關(guān)基因，以期為抗旱性遺傳改良提供靶標(biāo)基因。

參 考 文 獻(xiàn)

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