羅漢果內(nèi)生菌中產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

張昌志，范彩琴，龍楚媚，付 強(qiáng)，趙豐麗，2*

（1.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541006）

羅漢果（Siraitia grosvenori）是我國特有珍貴藥用和甜料植物，為葫蘆科多年生藤本植物，主要分布于廣西北部山區(qū)，具有潤腸通便[1]、抗氧化[2]、抗癌[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]、降血糖[5]、止咳祛痰[6]等功效。近年來羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIE、羅漢果苷VI、羅漢果苷V等11種苷成分已在羅漢果的果實(shí)中提取獲得[7]。羅漢果苷都具有相似的苷元，都以羅漢果醇為苷元骨架，葡萄糖為糖基供體，不同之處在于C3和C24位置上所連的葡萄糖基團(tuán)的數(shù)目和連接方式。李典鵬等[8]利用薄層色譜分析，研究發(fā)現(xiàn)苦味的苷IIE、苷III主要存在于果齡30 d果實(shí)中，30 d和40 d分別發(fā)現(xiàn)了苷III、IV，甜苷V直到70d時(shí)才出現(xiàn)且在85d其含量才達(dá)到最高，反映出了隨著果實(shí)的成熟苦苷轉(zhuǎn)化為甜苷。TANG Q等[9]報(bào)道，50～70 d甜苷V急劇積累期，果實(shí)中調(diào)控羅漢果苷元糖基化的二磷酸尿核苷葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（uridinediphosphateglucosyltransferase，UGT）基因表達(dá)水平大幅上調(diào)，說明羅漢果隨著果實(shí)的成熟苦苷轉(zhuǎn)化為甜苷的過程中，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮著重要的作用，也說明羅漢果中含有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。

到目前為止，在世界各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了可以產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（cyclodextrin glucosyltransferase，CGTase）的菌株，根據(jù)采樣地點(diǎn)的不同特性一般可分為兩種，一種是從極端環(huán)境取樣，如堿性土壤[10]、沙土[11]、海洋、湖泊[12]、火山、油井等。第二種是從底物富集地取樣，從含高濃度淀粉的土壤中分離篩選目的菌株，如玉米[13]、木薯[14]、大豆、土豆、甘蔗、黃豆、南瓜等的種植地[15]以及淀粉工廠原料廢物[16-17]。本研究從羅漢果內(nèi)生菌入手，從中篩選出高產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株進(jìn)行鑒定，在此基礎(chǔ)上，采用單因素和正交試驗(yàn)方法對(duì)該內(nèi)生菌的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期利用CGTase酶法改性羅漢果苦味苷、改變羅漢果苦味皂苷上葡萄糖基團(tuán)數(shù)目、從根本上解決苦果和苦苷的有效利用等問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

羅漢果：2015年10月采自廣西桂林市龍勝縣；編號(hào)為ND-3、ND-6、ND-10、NR-1、NR-4菌株均分離自健康羅漢果。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：稱取已去皮馬鈴薯200 g，切塊，煮30 min，四層紗布過濾，加入蔗糖20 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 L，pH自然，121℃滅菌25 min。

篩選培養(yǎng)基[18]：可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，酚酞0.3 g，甲基橙0.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH值，121℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 L，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，自然pH值，121℃滅菌15 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[18]：可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，自然pH值，121℃滅菌15 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

次氯酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；酚酞、甲基橙（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；馬鈴薯淀粉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZ200LB型恒溫?fù)u床、HP400S型生化培養(yǎng)箱：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；SY100型顯微鏡：日本Nikon公司；UV mini-1240型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；Epoch2微孔板分光光度計(jì)：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果內(nèi)生菌的分離純化

按參考文獻(xiàn)[19]中的方法對(duì)羅漢果的根、莖、果進(jìn)行消毒，對(duì)已消毒的羅漢果根、莖、果進(jìn)行剪切后，接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于28℃培養(yǎng)，定期觀察生長情況。待組織周圍長出菌落后，再進(jìn)行分離純化得到羅漢果的內(nèi)生菌。

1.3.2 產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的初篩

將方法1.3.1得到的羅漢果內(nèi)生菌分別接種于篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)部分菌株在甲基橙和酚酞背景下的平板內(nèi)出現(xiàn)淡黃色且近無色的斑點(diǎn)，究其原因在于酚酞在環(huán)糊精的疏水空腔內(nèi)會(huì)形成無色的二價(jià)陰離子[18，20]。挑出有黃色透明圈的菌株于種子培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，按4%（V/V）接種量接種于裝液量為50 mL/250 mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/min條件下培養(yǎng)72 h。經(jīng)5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。取200 μL粗酶液滴加至已打孔（d=1 cm）的篩選培養(yǎng)基平板上，40℃水浴2 h，測量黃色透明圈直徑大小。挑選出黃色透明圈大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.3 產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的復(fù)篩

粗酶液的制備：按照4%接種量將初篩菌株接種于裝液量為50mL/250mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、160r/min條件下培養(yǎng)72h。經(jīng)5000r/min離心10min，上清液為粗酶液。

酶活定義：單位時(shí)間內(nèi)使吸光度值下降10%的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U/mL）。

酶活的測定[21]：取10 μL適當(dāng)稀釋的初篩菌株的粗酶液，加入0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0）0.2 mL，再加入0.2%馬鈴薯淀粉0.2 mL，振蕩，于40℃水浴10 min后，立即加入0.5 mol/L的醋酸0.5 mL，終止反應(yīng)，然后加入0.005%碘液顯色。同時(shí)以蒸餾水為空白，以不加酶液為對(duì)照，在波長700 nm處測定吸光度值。酶活計(jì)算公式如下：

式中：a為對(duì)照組的吸光度值；b為樣品的吸光度值。

1.3.4 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌的鑒定

選取復(fù)篩中酶活性高且穩(wěn)定的菌株進(jìn)行菌種鑒定。

（1）形態(tài)學(xué)鑒定。將菌株劃線于PDA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～24 h，觀察菌落形狀、大小、表面光滑度、培養(yǎng)基顏色，并進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色[22]，觀察菌株細(xì)胞形態(tài)。

（2）分子生物學(xué)鑒定。將菌株送武漢華大基因科技有限公司，完成16SrDNA測序，將該菌株的16S rDNA序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行BLAST同源搜索，應(yīng)用MEGA軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 單因素試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

對(duì)復(fù)篩中選取的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行產(chǎn)酶單因素發(fā)酵條件研究?；井a(chǎn)酶發(fā)酵條件：1%的碳源、0.5%的氮源，pH自然，按4%的接種量將種子液接入裝液量為50 mL/250 mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/min條件下發(fā)酵72 h，考察不同單因素對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

碳源種類及添加量的確定：在基本產(chǎn)酶發(fā)酵條件下，分別添加1.0%可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉、環(huán)糊精、葡萄糖和乳糖代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，考察碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。然后再選擇最佳碳源，設(shè)置其添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察碳源添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

氮源種類及添加量的確定：依據(jù)基本產(chǎn)酶發(fā)酵條件，在碳源研究的基礎(chǔ)上，分別添加0.5%蛋白胨、尿素、干酪素、硫酸銨和檸檬酸銨代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，考察氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。然后再選擇最佳氮源，設(shè)置其添加量分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%，考察氮源添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

初始pH值的確定：考察初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

發(fā)酵溫度的確定：考察發(fā)酵溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

裝液量的確定：考察裝液量分別為50mL/250mL、70mL/250 mL、90 mL/250 mL、110 mL/250 mL、130 mL/250 mL時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

在單因素研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大的因素，選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大的因素，以CGTase酶活作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化[23-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的初篩結(jié)果

通過初篩從羅漢果內(nèi)生菌中篩選獲得11株CGTase產(chǎn)生菌，部分菌株酚酞甲基橙顯色結(jié)果如圖1所示。從中選出5株褪色明顯的內(nèi)生菌進(jìn)行復(fù)篩，分別在對(duì)數(shù)期（36 h）和穩(wěn)定期（72 h）對(duì)酶活進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

圖1 5株內(nèi)生菌酚酞甲基橙褪色結(jié)果Fig.1 Phenolphthalein methyl orange discoloration results of 5 strains of endophytic bacteria

表1 產(chǎn)CGTase菌株的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of CGTase-producing strains

由表1可知，在培養(yǎng)36 h進(jìn)行酶活測定時(shí)，不同菌株的酶活力相差較大，但在培養(yǎng)72 h后，測得5株菌株都有較強(qiáng)的酶活。說明菌株在對(duì)數(shù)期時(shí)生長活躍，但產(chǎn)酶較少，產(chǎn)酶主要在穩(wěn)定期。在72 h時(shí)測定菌株ND-6酶活最高為6 831 U/mL，菌株NR-4酶活較低為4 012U/mL；綜合考慮產(chǎn)酶活力，選擇產(chǎn)CGTase快且酶活高的菌株ND-6進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 菌株ND-6的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株ND-6的菌落及細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見圖2。由圖2a可知，在PDA培養(yǎng)基上，菌株ND-6菌落呈圓形，中間皺起，邊緣平整，略帶黃色。由圖2b可知，菌株在光學(xué)顯微鏡下呈桿狀，革蘭氏染色為陽性，有芽孢且位于菌體中間，初步得出該菌株屬于芽孢桿菌。

圖2 菌株ND-6的菌落(a)和細(xì)胞(b)形態(tài)Fig.2 Colony(a)and cell(b)morphology of strain ND-6

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

由武漢華大基因科技有限公司測得ND-6的16S rDNA基因序列堿基長度為1 445 bp，經(jīng)過同源性序列檢索，結(jié)果顯示菌株ND-6與Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillussp.、Bacillus velezensis等的16S rDNA 序列同源性高于99%。在搜索比對(duì)結(jié)果中選擇與菌株ND-6同源性較高的菌株，建立菌株ND-6的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株ND-6與Bacillus amyloliquefaciens聚于一支，相似度最高。結(jié)合菌株ND-6的形態(tài)觀察結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[25]，最終確定菌株ND-6為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 菌株ND-6基于16S rDNA序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain ND-6 based on 16S rDNA sequences

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 碳源種類及添加量的選擇

碳源種類對(duì)菌株ND-6產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，環(huán)糊精最有利于菌株ND-6產(chǎn)酶，酶活達(dá)到6 947 U/mL；可溶性淀粉次之，酶活為6 736 U/mL，乳糖和葡萄糖再次之，酶活分別為6 631 U/mL和6 000 U/mL，馬鈴薯淀粉也能產(chǎn)酶，但產(chǎn)酶水平遠(yuǎn)低于前述碳源，酶活只有1 894 U/mL。因此，選擇環(huán)糊精作為最佳碳源。

環(huán)糊精添加量對(duì)CGTase酶活影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著環(huán)糊精添加量的增加，CGTase酶活先增加后降低。當(dāng)環(huán)糊精添加量為0.5%～1.0%時(shí)，隨著環(huán)糊精添加量的增加CGTase酶活增大；當(dāng)環(huán)糊精添加量為1.0%時(shí)，酶活最高為6 852 U/mL；當(dāng)環(huán)糊精添加量為1.0%～2.5%時(shí)酶活呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選擇最佳環(huán)糊精添加量為1.0%。

圖4 不同碳源對(duì)CGTase酶活的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on CGTase activity

圖5 環(huán)糊精添加量對(duì)CGTase酶活的影響Fig.5 Effects of cyclodextrin addition on CGTase activity

2.3.2 氮源種類及添加量的選擇

氮源種類對(duì)菌株ND-6產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，蛋白胨為氮源時(shí)，酶活最高為6 736 U/mL，且不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力影響不一樣，說明氮源的選擇對(duì)產(chǎn)酶的影響十分重要。因此，選擇蛋白胨作為最佳產(chǎn)酶氮源。

圖6 不同氮源對(duì)CGTase酶活的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on CGTase activity

不同蛋白胨添加量對(duì)CGTase酶活影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，CGTase酶活隨著蛋白胨添加量的增加先升高后降低。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿吭?.25%～0.75%時(shí)，隨著蛋白胨添加量的增加CGTase酶活增大；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿吭?.75%時(shí)，此時(shí)酶活最大為6 538 U/mL；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿吭?.75%～1.25%時(shí)，CGTase酶活逐漸降低。因此選擇最佳蛋白胨的添加量為0.75%。

圖7 蛋白胨添加量對(duì)CGTase酶活的影響Fig.7 Effects of peptone addition on CGTase activity

2.3.3 裝液量的選擇

裝液量對(duì)菌株ND-6產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖8，由圖8可知，菌株產(chǎn)酶隨著裝液量的增加酶活呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明菌株產(chǎn)酶和生長需要一定的氧氣，菌株在裝液量為70 mL/250 mL時(shí)，酶活最高為5 684 U/mL。因此，選擇最佳裝液量為70 mL/250 mL。

圖8 不同裝液量對(duì)CGTase酶活的影響Fig.8 Effects of different loading volume on CGTase activity

2.3.4 培養(yǎng)基初始pH值的選擇

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株ND-6產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖9。

圖9 不同初始pH值對(duì)CGTase酶活的影響Fig.9 Effects of different initial pH value on CGTasee activity

由圖9可知，在菌株的發(fā)酵過程中，隨著培養(yǎng)基的初始pH值增加，CGTase活性先升高后降低，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為8.0時(shí)，酶活性最高為8 526 U/mL，這說明微堿性環(huán)境有利于菌株ND-6產(chǎn)酶。因此，選擇培養(yǎng)基最優(yōu)初始pH值為8.0。

2.3.5 發(fā)酵溫度的選擇

發(fā)酵溫度對(duì)菌株生長及產(chǎn)酶有很大的影響，合適的溫度對(duì)發(fā)酵效率和產(chǎn)酶的積累都很重要。培養(yǎng)溫度對(duì)菌株ND-6產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖10。由圖10可知，菌株在25～50℃范圍內(nèi)隨著溫度的增加酶活先升高后降低，產(chǎn)酶適宜范圍為40～50℃，且在45℃時(shí)具有最高的酶活力，酶活為9263U/mL。說明溫度為45℃時(shí)，適合菌株產(chǎn)酶。

圖10 不同發(fā)酵溫度對(duì)CGTase酶活的影響Fig.10 Effects of different fermentation temperatures on CGTase activity

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株ND-6的發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定裝液量為70mL/250mL，選擇環(huán)糊精（A）、蛋白胨（B）、初始pH值（C）、發(fā)酵溫度（D）為影響因素，CGTase酶活為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)研究不同因素對(duì)酶活的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 產(chǎn)CGTase發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of CGTase-producing fermentation conditions

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2、表3可知，在菌株產(chǎn)酶的過程中，各因素對(duì)產(chǎn)酶的影響程度各不相同。根據(jù)極差大小R值得出影響菌株ND-6產(chǎn)酶強(qiáng)弱順序?yàn)镈＞A＞B＞C，即初始pH值＞環(huán)糊精添加量＞蛋白胨添加量＞發(fā)酵溫度。由極差分析得出最佳產(chǎn)酶的條件為A2B3C1D2，即最佳培養(yǎng)條件為環(huán)糊精1.0%、蛋白胨1.0%、發(fā)酵溫度40℃、初始pH值8。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)菌株ND-6重新發(fā)酵產(chǎn)酶，即以蛋白胨10 g，環(huán)糊精10 g，酵母提取物5 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，配制發(fā)酵液，調(diào)節(jié)初始pH值為8.0，接種量為4%，裝液量為70 mL/250 mL，40℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，離心制備粗酶液，測得的CGTase酶活為9 753 U/mL。

3 結(jié)論

從羅漢果內(nèi)生菌中篩選出了一株高產(chǎn)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株ND-6，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定其為一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。通過單因素和正交試驗(yàn)得出最優(yōu)產(chǎn)酶發(fā)酵條件為環(huán)糊精1.0%作碳源、蛋白胨1.0%作氮源、發(fā)酵溫度40℃、初始pH值8.0，裝液量70 mL/250 mL。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，測得發(fā)酵液中的CGTase酶活可達(dá)9 753 U/mL，CGTase酶活是優(yōu)化前的1.43倍。

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