耐酸酵母菌株在沙棘果酒中的應(yīng)用研究

胡佳星，袁文艷，楊小沖，陳忠軍*，賈美芳，高 欣，丁鵬澤，張璐瑤

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

沙棘又稱醋柳、酸刺，被譽(yù)為“二十一世紀(jì)的長生果”。在我國沙棘的食用有著悠久的歷史，早在公元8世紀(jì)《四部醫(yī)典》中就已出現(xiàn)關(guān)于沙棘的記載[1]。沙棘含有上百種的化合物，包括必需氨基酸、維生素、黃酮等多種活性物質(zhì)[2]。沙棘中還含有較高含量的酚類和抗壞血酸，使沙棘具有較好的抗氧化和免疫功能[3-4]。除此之外，沙棘還可增加心肌細(xì)胞收縮率、改善心衰，還可降血壓、抗輻射、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病等[5-7]。近些年，研究人員發(fā)現(xiàn)沙棘及其種子的提取物還具有一定的抗菌功能[8]。馬榮山等[9]采用流加發(fā)酵的方式，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化，將沙棘釀成了果香飽滿，酒精度為11.8%vol的沙棘果酒。徐敏等[10]為克服傳統(tǒng)果酒發(fā)酵時(shí)間長、發(fā)酵不易控制、風(fēng)味較差等缺點(diǎn)采用生物降酸的方式，利用乳酸菌聯(lián)合酵母的發(fā)酵方法，制備一種新型的適合大眾飲用的沙棘酒。焦揚(yáng)等[11]發(fā)現(xiàn)沙棘果酒對(duì)自由基有較強(qiáng)的清除能力，尤其對(duì)羥基的清除率最高，可達(dá)97.98%。NEGI B等[12]試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘酒對(duì)氧化應(yīng)激及高血膽固醇癥均可起到一定的保護(hù)作用[12]，具有保健功效。雖然我國已將果酒作為酒類發(fā)展重點(diǎn)，但與歐美、日本等發(fā)達(dá)國家相比，我國果酒的生產(chǎn)發(fā)展起步較晚，生產(chǎn)工藝技術(shù)落后[13]，在菌株的篩選、育種、釀造及陳化工藝等方面與外國均有較大的差距[14]，因此探索沙棘果酒的生產(chǎn)工藝對(duì)于果酒的開發(fā)具有十分重要的作用。

沙棘果漿自然pH較低，在發(fā)酵過程中，由于酵母所產(chǎn)有機(jī)酸的不斷積累，使得發(fā)酵液的酸度進(jìn)一步增強(qiáng)[15]，酸度的增強(qiáng)不僅會(huì)影響酵母的生長繁殖，還會(huì)造成果酒酸澀、酒體粗糙等，因此選用在酸性脅迫下酵母細(xì)胞仍具備較好的細(xì)胞活性及發(fā)酵性能的酵母菌株對(duì)于沙棘果酒的生產(chǎn)極為重要。以沙棘為實(shí)驗(yàn)原料，將實(shí)驗(yàn)室保藏的能夠在pH1.8條件下存活的耐酸酵母菌株YM1-1E[16]作為發(fā)酵菌株，以感官評(píng)分及酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素及正交試驗(yàn)對(duì)沙棘果酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，以期得到酒體醇厚、口感細(xì)膩、酒精度高、果香濃郁的沙棘果酒，為沙棘果酒的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

耐酸酵母菌株YM1-1E：本實(shí)驗(yàn)室保藏；沙棘原漿：家樂福超市；檸檬酸鈉、檸檬酸（均為食品級(jí)）：大自然生物集團(tuán)有限公司；蔗糖：市售；偏重亞硫酸鉀（分析純）：天津大茂試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10精密電子pH計(jì)：德國Sartorius公司；SE602F電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；PAL-1糖度儀：日本TOKOY ATAGO公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養(yǎng)箱；太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；LRH-500F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WZB數(shù)顯折光儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：濟(jì)南來保醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果酒的工藝流程

沙棘原漿→調(diào)整成分（添加蔗糖將沙棘配料的糖度調(diào)整為23°Bx；以偏重亞硫酸的形式調(diào)整沙棘配料中SO2的質(zhì)量濃度）→接種（菌株YM1-1E活化，制備菌懸液）→恒溫120 r/min振蕩發(fā)酵→12℃陳釀90 d→過濾澄清（通過低溫，同時(shí)添加皂土澄清劑進(jìn)行澄清）→沙棘果酒

1.3.2 菌株的活化

將斜面保藏的YM1-1E菌株在無菌環(huán)境中接種于酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，將其以2%的接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，并在28℃的條件下培養(yǎng)48 h，根據(jù)以上操作再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以下實(shí)驗(yàn)均使用第3代菌液。

1.3.3 制備菌懸液

將10 mL三代菌液在4 000 r/min的條件下離心3 min后倒掉上清液，并用無菌生理鹽水將離心的菌泥進(jìn)行洗滌，用漩渦儀混合均勻后，依據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)的方法，將活菌濃度調(diào)整為1×108CFU/mL。

1.3.4 沙棘果酒的生產(chǎn)工藝的優(yōu)化

（1）沙棘與水配比：在接種量為3%，初始pH值為3.5，SO2添加量為60 mg/L的條件下，將沙棘與水按照1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的體積比進(jìn)行配制，在24 ℃條件下恒溫發(fā)酵10 d，以酒精度和感官評(píng)定為考察指標(biāo)，分析沙棘與水的比例對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響。

（2）SO2添加量：在初始pH為3.5，接種量為3%，料水比為最佳的條件下，調(diào)整SO（2偏重亞硫酸）添加量分別為30 mg/L、60 mg/L、90 mg/L、120 mg/L、150 mg/L，于24 ℃條件下發(fā)酵10 d，以酒精度和感官評(píng)定為考察指標(biāo)，分析SO2添加量對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響。

（3）初始pH：采用最佳的SO2添加量、料水比，接種量為3%，用檸檬酸和檸檬酸鈉將初始pH分別調(diào)為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，接種后于24℃條件下恒溫發(fā)酵10 d，以酒精度和感官評(píng)定為考察指標(biāo)，分析初始pH對(duì)沙棘果酒發(fā)酵的影響。

（4）接種量：在初始pH、SO2添加量及料水比均為最佳的基礎(chǔ)上，按照沙棘配料體積分?jǐn)?shù)的1%、2%、3%、4%、5%的接種量分別進(jìn)行接種[17]，24℃恒溫發(fā)酵10 d后，以酒精度和感官評(píng)定為考察指標(biāo)，分析接種量對(duì)沙棘果酒發(fā)酵的影響。

（5）發(fā)酵溫度：在料水比、接種量、初始pH以及SO2添加量均為上述試驗(yàn)最佳的條件下，將沙棘配料分別放在20℃、22℃、24℃、26℃、28℃的溫度條件下恒溫發(fā)酵10d，以酒精度和感官評(píng)定為考察指標(biāo)，分析發(fā)酵溫度對(duì)沙棘果酒發(fā)酵的影響。

（6）發(fā)酵時(shí)間：采用已確定的接種量、配料初始pH、料水比及SO2添加量，按照最佳的發(fā)酵溫度恒溫發(fā)酵6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，以酒精度和感官評(píng)定為考察指標(biāo)，分析發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響。

1.3.5 指標(biāo)檢測(cè)方法

感官評(píng)定方法：邀請(qǐng)13位實(shí)驗(yàn)室成員對(duì)發(fā)酵后的沙棘果酒進(jìn)行品嘗，以表1為感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)沙棘果酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)定分?jǐn)?shù)為100分制，感官評(píng)價(jià)最終得分為13人評(píng)分的平均值。

表1 沙棘果酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of seabuckthorn wine

可溶性浸出物含量：采用數(shù)顯式折光儀進(jìn)行檢測(cè)；殘?zhí)呛浚菏褂帽銛y式手持糖度計(jì)進(jìn)行測(cè)定；酒精度：依據(jù)國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精計(jì)法[18]測(cè)定；糖醇轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下[19]：

式中：S指糖醇轉(zhuǎn)化率，%；C指酒精度，%vol；G指糖度，°Bx。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用Excel軟件處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果酒發(fā)酵工藝研究單因素試驗(yàn)

2.1.1 沙棘與水的體積比對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響

圖1 沙棘原漿與水的體積比對(duì)沙棘果酒品質(zhì)影響Fig.1 Effect of seabuckthorn pulp to water volume ratio on seabuckthorn wine quality

由圖1可知，不同沙棘與水體積比對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響比較明顯，隨著沙棘與水體積比的增大，酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。沙棘原漿濃度過大使得沙棘配料滲透壓增大，酵母細(xì)胞失水，抑制了細(xì)胞的代謝活動(dòng)，所產(chǎn)果酒酒精度偏低。沙棘原漿與水體積比在1∶6的條件下，發(fā)酵的沙棘果酒酒精度與感官評(píng)分均達(dá)到最大，分別為11.4%vol和82.3分。隨著水比例的增大，沙棘原漿中的組分被稀釋，原漿濃度降低，導(dǎo)致發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分無法滿足酵母的增殖與發(fā)酵需要，因而隨著沙棘配料中水比例的增加酒精度逐步遞減。所以沙棘原漿與水最佳的體積比為1∶6。

2.1.2 SO2添加量對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響

圖2 SO2添加量對(duì)沙棘果酒品質(zhì)影響Fig.2 Effect of SO2addition on seabuckthorn wine quality

由圖2可知，SO2添加量過高或過低均會(huì)影響沙棘果酒的品質(zhì)。適量的SO2能夠起到一定的抗氧化作用，避免果酒因氧化而變色，同時(shí)還可抑制雜菌的生長，但較低的SO2質(zhì)量濃度不能有效地抑制雜菌的生長和沙棘果漿的氧化，雜菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及次級(jí)代謝產(chǎn)物的分泌，使得沙棘果酒酒精度偏低，風(fēng)味較差；同時(shí)高質(zhì)量濃度的SO2對(duì)會(huì)酵母自身的生長及發(fā)酵性能產(chǎn)生抑制作用，使沙棘果酒具有刺鼻性氣味，影響果酒的風(fēng)味和口感[20]。當(dāng)SO2添加量為30～120mg/L時(shí)，沙棘果酒酒精度與感官評(píng)分均隨SO2添加量的增加而增大；當(dāng)SO2添加量為120 mg/L時(shí)，沙棘果酒酒精度與感官評(píng)分均達(dá)到最大，分別是11%vol和85.0分；當(dāng)SO2添加量＞120 mg/L之后，沙棘果酒酒精度與感官評(píng)分均隨之下降。所以沙棘果酒發(fā)酵最適宜的SO2添加量為120 mg/L。

2.1.3 初始pH對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響

圖3 初始pH對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of initial pH on seabuckthorn wine quality

由圖3可知，當(dāng)初始pH值為3.5～5.5時(shí)，隨著初始pH增大，酵母生長良好，其發(fā)酵性能逐漸提高，酒精度及感官評(píng)分呈上升趨勢(shì)；當(dāng)初始pH值為5.0時(shí)，沙棘果酒酒精度與感官評(píng)分均達(dá)到最大，分別為11.9%vol和87.5分；當(dāng)初始pH＞5.0時(shí)，沙棘果酒酒體渾濁，色澤變暗，口感變差，酒精度下降，因?yàn)檫^高的pH使沙棘果漿中的部分營養(yǎng)成分變性，破壞了其中的營養(yǎng)物質(zhì)，果漿顏色變暗，從而降低沙棘果酒的品質(zhì)，因此選擇沙棘配料最佳的初始pH值為5.0。

2.1.4 接種量對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響

圖4 接種量對(duì)沙棘果酒品質(zhì)影響Fig.4 Effect of inoculum on seabuckthorn wine quality

由圖4可知，但接種量在1%～3%時(shí)，酒精度及感官評(píng)分隨接種量的增加呈上升趨勢(shì)；當(dāng)接種量為3%時(shí)，沙棘果酒的感官評(píng)分與酒精度均為最高分別為11.7%vol和84.0分。在一定程度上擴(kuò)大接種量不僅可加速酵母繁殖，還能夠提高沙棘果酒的發(fā)酵速度。當(dāng)接種量過大（＞3%）時(shí)，沙棘果酒的感官評(píng)分與酒精度會(huì)隨之降低，因?yàn)榻湍讣恿窟^大時(shí)發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗大部分用于酵母的生長繁殖，以致沒有足夠的糖分可轉(zhuǎn)化為酒精，使酒精度降低。同時(shí)過量的酵母還會(huì)使果酒出現(xiàn)酵母異味，掩蓋沙棘果香，使果酒的口感及風(fēng)味變差[21]。因此選擇沙棘果酒釀造最佳的接種量為3%。

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)沙棘果酒品質(zhì)影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on seabuckthorn wine quality

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，沙棘果酒酒精度與感官評(píng)分均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為16℃時(shí)，沙棘果酒的感官評(píng)分與酒精度均較低，在低溫條件下，菌株生長較慢，代謝速率偏低，發(fā)酵不足。在發(fā)酵溫度為24℃時(shí)，沙棘果酒的酒精度為11.7%vol，略低于發(fā)酵溫度為28℃時(shí)的葡萄酒，但其口感及風(fēng)味較好，感官評(píng)分較高。隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵速率加快，使得酵母過早的衰敗導(dǎo)致發(fā)酵終止[22]，因此感官品評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度控制在24℃時(shí)，釀制的沙棘果酒果香飽滿、口感柔和，因此選擇沙棘果酒最佳的發(fā)酵溫度為24℃。

2.1.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘果酒品質(zhì)影響Fig.6 Effect of fermentation time on seabuckthorn wine quality

由圖6可知，沙棘果酒的酒精度及感官評(píng)分伴隨著發(fā)酵時(shí)間在6～10d范圍內(nèi)的延長呈上升趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵10d時(shí)，所釀沙棘果酒酒體協(xié)調(diào)、酸甜適中，并且有明顯的沙棘果香，酒精度可達(dá)11.8%vol；發(fā)酵10 d后，發(fā)酵停止，此后的沙棘果酒酒精度與感官評(píng)分無明顯差異，因此選擇沙棘果酒最佳發(fā)酵時(shí)間為10 d。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

通過對(duì)單因素水平試驗(yàn)進(jìn)行分析，選擇對(duì)沙棘果酒品質(zhì)影響較顯著的接種量（A）、SO2添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）及初始pH（D）作為影響沙棘果酒發(fā)酵的主要因素，固定發(fā)酵時(shí)間為10 d，沙棘與水的體積比為1∶6，依據(jù)試驗(yàn)因素與水平（表2）設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以沙棘果酒的酒精度及感官評(píng)定為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定沙棘果酒最佳的發(fā)酵工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見表2，結(jié)果與分析見表3。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

由表3可知，當(dāng)以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)分析時(shí)，對(duì)4個(gè)因素極差進(jìn)行比較，極差R的重要次序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞初始pH＞接種量＞SO2添加量，表明發(fā)酵溫度對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響最大。當(dāng)從感官評(píng)定為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析時(shí)，由極差R可知各因素對(duì)沙棘果酒感官影響次序?yàn)椋撼跏紁H＞發(fā)酵溫度＞接種量=SO2添加量，表明初始pH對(duì)沙棘果酒品質(zhì)的影響最大。結(jié)果顯示沙棘果酒釀造的最優(yōu)工藝組合為A2B1C3D3，即沙棘與水的體積比為1∶6，酵母菌接種量3.0%，SO2添加量105 mg/L，初始pH 5.3，發(fā)酵溫度25 ℃發(fā)酵10 d。在此最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的沙棘果酒色澤均勻、果香濃郁、口感細(xì)膩、有明顯的酒香味，酒精度為12.7%vol，殘?zhí)菫?.6°Bx，糖醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)48.75%，感官評(píng)分為89.0分。

2.3 沙棘果酒質(zhì)量指標(biāo)

2.3.1 感官指標(biāo)

色澤：呈金黃色、色澤均勻、酒體協(xié)調(diào)、無雜色現(xiàn)象、無沉淀與分層現(xiàn)象；風(fēng)味：具有沙棘特有的風(fēng)味，果香飽滿濃郁、無異味；口感：醇綿可口、酸甜適中、細(xì)膩柔和。

2.3.2 理化指標(biāo)

酒精度：12.7%vol；殘?zhí)呛浚?.6°Bx；可溶性固形物含量：18.4%。

2.3.3 衛(wèi)生指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤100 CFU/mL；大腸桿菌≤3 MPN/100 mL；致病菌未檢出。符合國標(biāo)GB/T 5009.49—2008《發(fā)酵酒及其配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的耐酸酵母菌株YM1-1E為試驗(yàn)菌株，將其應(yīng)用于沙棘果酒的發(fā)酵，經(jīng)單因素及正交試驗(yàn)得到沙棘果酒最佳的生產(chǎn)工藝條件為沙棘與水的體積比為1∶6，發(fā)酵溫度25℃，酵母菌接種量3.0%，SO2添加量105mg/L，沙棘配料初始pH 5.3，發(fā)酵時(shí)間10 d。在此優(yōu)化工藝條件下發(fā)酵的沙棘果酒，酒體協(xié)調(diào)、色澤均勻、果香飽滿、口感酸甜，酒精度為12.7%vol，感官評(píng)分為89.0分。理化指標(biāo)與衛(wèi)生指標(biāo)均達(dá)到國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，對(duì)沙棘果酒的研發(fā)與生產(chǎn)有一定的參考價(jià)值。

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