海洋高產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

李 蓉，喬 慧，王曉輝，張慶芳，遲乃玉*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）EC1.1.3.4是一類同源二聚體糖蛋白酶，能夠以分子氧為電子受體，高效催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸并產(chǎn)生過氧化氫[1-2]。GOD具有分解葡萄糖、除氧、抑菌、保鮮等[3]作用，被廣泛用于葡萄糖傳感器、食品、生物燃料電池、飼料添加劑等[4-7]領(lǐng)域。

GOD普遍存在微生物與昆蟲體內(nèi)，前者因代謝優(yōu)勢成為研究重點(diǎn)?，F(xiàn)有生產(chǎn)GOD野生菌株的研究集中于黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉屬（Penicilliumsp.）的少數(shù)種類[8]。前者合成胞內(nèi)酶，后者可分泌胞外酶，同時(shí)青霉屬分泌的酶催化能力更強(qiáng)[9-10]。目前菌株GOD酶活普遍較低[11-12]，市場價(jià)格昂貴，同時(shí)商品化的GOD基本為中高溫酶[13]，低溫（0～20℃）條件下催化效率低。這些不足限制了其在水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品低溫保鮮等領(lǐng)域的應(yīng)用。海洋環(huán)境常年低溫、寡營養(yǎng)的特點(diǎn)，孕育的微生物只需較低營養(yǎng)水平即可存活，并且通常會(huì)合成低溫酶[14]。因此，本研究以黃海、渤海海泥為樣品來源，篩選高產(chǎn)低溫GOD菌株，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和酶譜分析，對所產(chǎn)GOD分子質(zhì)量和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，以期為低溫GOD的開發(fā)與應(yīng)用提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

海泥樣品：采自大連黃海、渤海海域。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，渤海海水1 L，pH自然。121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，渤海海水1 L，pH自然。121℃滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨3 g/L，NaNO33 g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.1g/L，CaCO310 g/L，鄰聯(lián)茴香胺7.5 mL/L，辣根過氧化物酶1.25 mL/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。其中CaCO3單獨(dú)滅菌，鄰聯(lián)茴香胺及辣根過氧化物酶參照范新蕾[15]的方法制備并過濾除菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.90 g/L，胰蛋白胨1.2 g/L，K2HPO41.25g/L，MgSO4·7H2O1.30g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O1.80g/L，CaCO325.00 g/L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然。121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

蛋白Marker：美國Thermo Fisher Scientific公司；鄰聯(lián)茴香胺：美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（60 U/mL）、Ezup柱式真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；引物：由上海生工生物工程股份有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DC-6低溫循環(huán)水浴鍋：江蘇金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；HD-1360超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Multifugn XIR離心機(jī)、2700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、MultiskanTMGO全波長酶標(biāo)儀：美國ThermoFisherScientific公司；DYY-6C電泳儀、DYY-4C電泳儀：北京六一儀器廠；BSD-YX（F）3200恒溫?fù)u床：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；AmiconUltra-15 30 kDa超濾管：美國Millipore公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱：美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 篩選方法

菌株的初篩：稱取1g海泥樣品接種于富集培養(yǎng)基，20℃、160 r/min培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于初篩培養(yǎng)基上，20℃倒置培養(yǎng)3～7 d，挑取產(chǎn)生棕色圈的菌株，經(jīng)多次分離純化后得到的單菌落作為初篩菌。

菌株的復(fù)篩：使用無菌生理鹽水洗滌種子培養(yǎng)基上生長成熟的孢子，制成懸浮液（孢子數(shù)控制在106CFU/mL），以1%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20℃、160r/min培養(yǎng)24h，測GOD酶活，選取酶活最高的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：通過觀察種子培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，鏡檢菌株菌絲及分生孢子形態(tài)，對復(fù)篩菌株進(jìn)行初步鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：采用Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取目的菌株DNA。利用ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）PCR擴(kuò)增目的菌株ITSrDNA序列（PCR擴(kuò)增體系：1 μL PCR產(chǎn)物（10 ng/μL），8 μL BigDye（2.5 x），1 μL 引物（3.2 pmol/μL），10 μL 滅菌去離子水；PCR擴(kuò)增條件：96℃預(yù)變性1 min，96℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4min，25個(gè)循環(huán)，4℃保溫）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）中進(jìn)行本地序列基本搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源比對，選取同源性較高的菌株ITSrDNA序列，采用MEGA5.0軟件中鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 純酶液的制備

粗酶液制備：菌株發(fā)酵液使用新華1號濾紙過濾除去菌球，濾液經(jīng)8000r/min離心20min，收集上清液即為粗酶液。

硫酸銨鹽析：粗酶液中添加硫酸銨至飽和度為70%，4℃鹽析24h。鹽析溶液經(jīng)12000r/min離心10min，棄上清，得到蛋白沉淀。

超濾：蛋白沉淀經(jīng)1 mol/L pH 7.0的磷酸鈉緩沖液復(fù)溶后，使用Millpore 30 kDa超濾管在4 000 r/min條件下超濾20 min，取上層截留蛋白備用。

葡聚糖凝膠柱層析：選用Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱，取超濾后的蛋白上樣，采用0.2 mol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液洗脫，層析后收集純GOD酶溶液。

1.3.4 葡萄糖氧化酶活力的測定

H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：本實(shí)驗(yàn)在范新蕾[15]對GOD檢測方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)：在25 mL刻度試管中分別加入0.4 mL 10%葡萄糖溶液，2.5 mL鄰聯(lián)茴香胺溶液，0.1 mL辣根過氧化物酶溶液（60 U/mL）以及0～1 mL濃度44.1 μmol的H2O2溶液，20℃反應(yīng)1 min，加入2 mL5 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，加蒸餾水至10 mL刻度線，在波長525 nm處測定吸光度值，以H2O2濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)525nm（y）為縱坐標(biāo)，繪制H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中GOD酶活的測定：以純酶液替代反應(yīng)體系中的H2O2測定吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中H2O2含量及GOD酶活力。

葡萄糖氧化酶酶活定義：20℃條件下（pH值為7），1min催化生成1μmolH2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

研討會(huì)于2018年9月20日在黑河學(xué)院明德樓2樓會(huì)議室舉行，共有來自北京大學(xué)、北京市社會(huì)科學(xué)院、黑龍江省社會(huì)科學(xué)院、齊齊哈爾大學(xué)、蒙古國成吉思汗大學(xué)、俄羅斯阿穆爾國立大學(xué)、日本城西國際大學(xué)、金澤星稜大學(xué)、松蔭大學(xué)，以及黑河學(xué)院部分單位的專家學(xué)者近20人。

相對酶活的測定：在一定反應(yīng)體系下，某一條件下的酶活與最高酶活比值的百分比，即為GOD在該條件下的相對酶活（%）。

1.3.5 SDS-PAGE和酶譜實(shí)驗(yàn)

SDS-PAGE參照LAEMMI U K[16]的方法進(jìn)行。電泳后，使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色?；钚噪娪驹诓缓琒DS和2-巰基乙醇的10%聚丙烯凝膠酰胺中進(jìn)行。酶譜實(shí)驗(yàn)在電泳后，凝膠浸沒于含0.1%的葡萄糖，2.5mmol/L鄰聯(lián)茴香胺和20μg/mL辣根過氧化物酶的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0 20 mmol/L）中，室溫染色20min。GOD活性條帶呈現(xiàn)棕紅色。根據(jù)SDS-PAGE和酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量，確定GOD的分子質(zhì)量。

1.3.6 葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究

酶的最適作用溫度：在pH 7.0條件下，分別于不同溫度（0、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）條件下測定GOD酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。

酶的熱穩(wěn)定性：在pH 7.0條件下，將酶與緩沖液置于不同溫度條件（0、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）條件下保溫60 min后，以同組最高酶活為100%，計(jì)算各條件下GOD的相對酶活。

酶的最適作用pH值：在最適反應(yīng)溫度條件下，分別測定不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）反應(yīng)體系中的GOD酶活力，確定最適反應(yīng)pH。

酶的pH值穩(wěn)定性：在最適反應(yīng)溫度條件下，將GOD于不同pH的緩沖體系（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）中保溫60 min后測定酶活力，以同組最高酶活為100%，計(jì)算各條件下GOD的相對酶活。

金屬離子對酶活的影響：在最適反應(yīng)溫度條件下，反應(yīng)體系中分別添加不同金屬離子（K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、NH4+、Fe3+、Mn2+），使金屬離子終濃度為5 mmol/L，測定不同條件下GOD酶活力，以未加金屬離子的反應(yīng)體系為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

從海泥中初篩到12株產(chǎn)棕色圈菌株，作為初篩葡萄糖氧化酶生產(chǎn)菌株，各菌株GOD酶活測定結(jié)果見表1。由表1可知，12株菌的GOD酶活為0.63～11.84 U/mL，其中菌株G01的GOD酶活最高，進(jìn)一步對其進(jìn)行鑒定。

表1 篩選菌株的葡萄糖氧化酶酶活Table 1 Glucose oxidase activities of screened strains

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株G01的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見圖1。由圖1A可知，該菌在初篩培養(yǎng)基上生長良好，初期菌絲呈白色，圓形，中心凸起，菌落周圍先產(chǎn)生棕色圈。由圖1B可知，隨著菌落逐漸成熟，棕色圈逐漸褪去，產(chǎn)孢子后菌落表面呈綠色，粉末狀。這種現(xiàn)象與文獻(xiàn)[17]所報(bào)道GOD生產(chǎn)變化趨勢一致。由圖1C可知，菌株G01菌體頂端呈掃帚狀，存在分生孢子梗，其上有球狀分生孢子。初步判斷菌株G01屬于青霉屬（Penicilliumsp.）。

圖1 菌株G01菌落(A，B)及細(xì)胞(C)形態(tài)Fig.1 Colony(A,B)and cell(C)morphology of strain G01

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株G01的ITS rDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在563 bp處有目的基因（GeneBank登錄號MG983918）。

圖2 菌株G01 ITS rDNA基因的PCR產(chǎn)物結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification product of ITS rDNA gene of strain G01

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株G01的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，菌株G01與殼青霉（Penicillium crustosum）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果確定菌株G01為一株殼青霉（Penicillium crustosum）。

圖3 菌株G01基于ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS rDNA gene sequences

2.3 SDS-PAGE及酶譜實(shí)驗(yàn)

純化后GOD的SDS-PAGE和酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4A可知，菌株G01所產(chǎn)GOD其單體大小為17 ku，與石漱玉等[18]的所報(bào)道的單體分子質(zhì)量接近。由圖4B可知，GOD分子質(zhì)量為95 ku。結(jié)合SDS-PAGE及酶譜實(shí)驗(yàn)初步判斷該菌所產(chǎn)GOD為五聚體，與已報(bào)道[9]GOD為二聚體酶結(jié)果不同，推測該酶可能為一種新酶。

圖4 葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE電泳圖和酶譜分析Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis and zymography analysis of glucose oxidase

2.4 葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.4.1 酶的最適作用溫度

由圖5可知，在0～25℃范圍內(nèi)，GOD酶活隨溫度的升高快速增大；當(dāng)溫度高于25℃時(shí)，酶活開始逐漸減??；當(dāng)溫度高于35℃時(shí)，酶活迅速降低，至溫度為55℃時(shí)，酶活僅存1.14 U/mL。因此，菌株G01所產(chǎn)GOD在低溫條件下具有高催化效率，最適作用溫度為25℃。

圖5 溫度對菌株G01產(chǎn)葡萄糖氧化酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on glucose oxidase activity produced by strain G01

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性

由圖6可知，GOD在0℃處理60 min后，仍保留有50%以上的相對酶活，并且在4～20℃處理后，相對酶活仍基本保持100%。但在溫度高于20℃時(shí)，該酶相對酶活迅速降低，表明該GOD對熱敏感。結(jié)合該酶的最適作用溫度，表明該GOD擁有典型的低溫酶特征，屬于低溫酶。

圖6 菌株G01產(chǎn)葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of glucose oxidase produced by strain G01

2.4.3 酶的最適作用pH值

由圖7可知，反應(yīng)體系pH值＜4.5時(shí)，酶的活性隨pH的升高而增大；當(dāng)pH值＞4.5時(shí)，酶活迅速降低；當(dāng)pH值為4.5時(shí)，GOD酶活最高，為14.95 U/mL，因此該GOD最適作用pH值為4.5。

圖7 pH對菌株G01產(chǎn)葡萄糖氧化酶活的影響Fig.7 Effect of pH on glucose oxidase activity produced by strain G01

2.4.4 酶的pH值穩(wěn)定性

圖8 菌株G01產(chǎn)葡萄糖氧化酶的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of glucose oxidase produced by strain G01

由圖8可知，該酶對pH值的穩(wěn)定性差，過酸或過堿均會(huì)使其相對酶活降低，僅在pH值為4.5時(shí)活性穩(wěn)定。因此，該GOD在后續(xù)應(yīng)用中，應(yīng)注意控制環(huán)境pH值。

2.4.5 金屬離子對酶活的影響

本研究選擇環(huán)境中常見離子，研究其對GOD酶活的影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知，Mn2+對酶的活性有促進(jìn)作用；K+和Na+對酶活無顯著影響；而Mg2+、Ca2+、NH4+、Cu2+、特別是Fe3+對酶活有明顯抑制作用。

圖9 不同金屬離子對菌株G01產(chǎn)葡萄糖氧化酶酶活性的影響Fig.9 Effect of different metal ions on glucose oxidase activity produced by strain G01

3 結(jié)論

本研究從黃海、渤海海域海泥樣品中篩選到12株產(chǎn)GOD菌株，其中菌株G01產(chǎn)酶能力最高，該菌株在20℃、160 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，酶活可達(dá)到11.8 U/mL。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析，鑒定菌株G01為一株殼青霉（Penicillium crustosum）。結(jié)合SDS-PAGE和酶譜分析初步確定菌株G01所產(chǎn)GOD單聚體分子質(zhì)量為17 ku；與多數(shù)文獻(xiàn)所報(bào)道的GOD為二聚體蛋白不同，該GOD蛋白分子質(zhì)量為95 ku，推測該酶為五聚體，這可能是海洋微生物合成GOD的特點(diǎn)，該酶可能為一種新型GOD。同時(shí)，該GOD分子質(zhì)量較小，可以更容易通過縫隙與底物接觸，分析這可能是該酶相比其他來源GOD具有更高活性的原因。菌株G01所產(chǎn)GOD酶學(xué)初步性質(zhì)顯示該酶最適反應(yīng)溫度低（25℃），0～20℃時(shí)仍保留有50%以上的相對酶活，熱穩(wěn)定性差，為典型低溫酶；最適反應(yīng)pH值為4.5，且pH值穩(wěn)定性差，屬于酸性葡萄糖氧化酶，適于作為水產(chǎn)飼料添加劑；Mn2+對GOD活性有促進(jìn)作用；K+，Na+對酶活基本無影響；而Mg2+、Ca2+、NH4+、Cu2+、特別是Fe3+對酶活有明顯抑制作用。

本研究取得的成果，為潛在新型海洋低溫GOD的開發(fā)及其在低溫、水產(chǎn)飼料領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將進(jìn)一步研究該酶克隆表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化等實(shí)驗(yàn)，以期實(shí)現(xiàn)海洋低溫GOD的生產(chǎn)應(yīng)用。

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