牛磺酸鎂抗豚鼠尖端扭轉(zhuǎn)型室速的作用研究*

李 燕，孫 凱，安夢瑤，潘瑩瑩，孫 濤，尹永強，康 毅，婁建石△

（1.天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，天津300070；2.天津市武清區(qū)人民醫(yī)院，天津301700）

尖端扭轉(zhuǎn)型室速（torsades de Pointes，TdP）是一類特殊的快速室性心律失常，心電圖特點是QRS波群增寬變形且振幅不等地在等電位線上下扭動，通常在原發(fā)或繼發(fā)性LQTS（long QT syndrome）的基礎(chǔ)上發(fā)生，臨床上常表現(xiàn)為暈厥和心源性猝死［1］。目前，一般認為TdP的發(fā)生與折返和觸發(fā)活動有關(guān)［2］。心臟心室復(fù)極延緩可引起早后除極（early afterdepolarization，EAD），形成觸發(fā)活動，啟動 TdP的發(fā)生；而心室復(fù)極延緩造成的心室肌異質(zhì)性進一步增大，易形成折返，從而維持TdP的發(fā)生［3］。

迄今為止，治療TdP的方法主要分為手術(shù)和藥物兩大類。手術(shù)治療方面主要包括頸交感神經(jīng)切除術(shù)、安裝起搏器［4］以及埋藏式復(fù)律除顫器（implantable cardioverter defibrillator，ICD）等［5］。其中，ICD預(yù)防和治療猝死效果最好，但費用昂貴，存在誤放電、反復(fù)更換等問題。藥物治療方面可應(yīng)用的有利多卡因、硫酸鎂［6，7］、阿托品等，但藥物治療的效果有限。因此，研究治療TdP的新藥仍然是該領(lǐng)域內(nèi)的熱點與難點。

牛磺酸鎂配位化合物（taurine magnesium coordination compound，TMCC）是以牛磺酸為配體，與痕量金屬離子鎂（Mg2+）配位結(jié)合得到的新型化合物，已進行了抗心律失常作用的篩選研究。研究表明，TMCC防治氯化鈣、哇巴因、烏頭堿、腎上腺素誘導的心律失常效果肯定，且呈明顯劑量依賴關(guān)系［8］。此外，本室前期在離體心臟水平的研究中發(fā)現(xiàn)，TMCC可減慢心率、延長有效不應(yīng)期。因此，我們設(shè)想TMCC可能具有抗TdP的作用。本實驗將探索TMCC抗TdP的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重250～350 g的健康成年雄性豚鼠（SPF級，SCXK-2014-0012），購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.2 藥品與試劑

Chromanol 293B，批號：06798368，sigma；TMCC，由天津醫(yī)科大學藥理學教研室合成。NaCl，分析純（批號：20141124）；KCl，分析純（批號：20150506）；葡萄糖（glucose），分析純（批號：20141028），均購自天津市風船化學試劑科技有限公司。KH2PO4，分析純（批號：20110306）；CaCl2，分析純（批號：20140903）；NaHCO3，分析純（批號：20150803），均購自天津市光復(fù)精細化工研究所。MgSO4，分析純（批號：20110811），購自天津市化學試劑批發(fā)公司。二甲亞砜（DMSO），Amresco分裝，美國。烏拉坦，化學純（批號：20140923），上海山浦化工有限公司。0.9%生理鹽水，百特國際有限公司。

1.3 主要儀器

Langendorff灌流裝置（GL-2），超級恒溫水?。℉W-1000），成都泰盟軟件有限公司；BIOPAC／MP150，美國BioPac；心電圖記錄電極，實驗室自制；FA1104型電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；LD動物稱量秤，沈陽龍騰電子有限公司；PHS-3C型酸度計，上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠。

1.4 實驗分組

（1）TdP模型組；（2）TdP模型 +1 mmol／L TMCC組；（3）TdP模型 +2 mmol／L TMCC組；（4）TdP模型+4 mmol／L TMCC組。

1.5 液體配制

1.5.1 K-H灌流液（mmol／L） NaCl 118.5，KCl 4.7，MgSO41.2，CaCl21.8，NaHCO324.8，KH2PO41.2，glucose 10。預(yù)先通入混合氧氣（95%O2+5%CO2），20min后調(diào)節(jié)pH值至7.4。

1.5.2 低鉀 K-H灌流液（mmol／L） 除總鉀離子濃度降為 1.8mmol／L（減少的 KCl用等摩爾量的 NaCl代替）外，其余試劑組成同K-H灌流液。預(yù)先通入混合氧氣（95%O2+5%CO2），20min后調(diào)節(jié)pH值至7.4。

1.5.3 藥物母液 Chromanol 293B（40 mmol／L），用DMSO溶解配制而成；TMCC（200 mmol／L），用純水溶解配制而成；實驗過程中確保DMSO濃度不超過千分之一。

1.6 離體心臟摘取及Langendorff豚鼠離體心臟灌流法

取健康成年雄性豚鼠，稱重，腹腔注射25%烏拉坦1.0 g／kg麻醉。將豚鼠仰臥位固定于鼠臺上，剪去胸部毛發(fā)。快速剪開胸腔暴露心臟，從主動脈根部剪斷主動脈后游離出心臟，放入預(yù)冷（4℃）的K-H灌流液中，輕輕按壓，擠出心臟中殘余血液。修剪除去脂肪、結(jié)締組織及心包膜。將灌流裝置插管末端逆行插入主動脈，以預(yù)處理過的（預(yù)處理包括：配制好的液體進行通氧、調(diào)PH值，以及在灌流前先將灌流液放在37℃恒溫水浴中預(yù)熱）K-H灌流液在37℃恒溫水浴條件下灌流，灌注壓 60～70 mmHg。從游離出心臟到實現(xiàn)心臟灌流的過程最好不超過1 min，以免缺血時間過長對心臟造成較大損傷。同時要控制好主動脈插管深度，以免影響心臟正常搏動。固定好心臟，觀察心臟逐漸恢復(fù)跳動，心臟呈嫩粉色，無梗死區(qū)域，無室顫。心臟搏動穩(wěn)定后，將心電圖記錄電極的正、負極分別貼附在心尖和主動脈根部，記錄心電圖。給藥前心臟需平衡20 min，以保證能連續(xù)記錄到穩(wěn)定的心電圖，進行后續(xù)實驗。

1.7 觀測指標

1.7.1 各組離體心臟TdP發(fā)生率 觀察從造模開始60min內(nèi)的TdP發(fā)生情況。

1.7.2 跨室壁復(fù)極離散度（transmural dispersion of repolarization，TDR）一個心動周期中從T波波峰至T波終止的時程段（Tpeak-Tend，Tp-Te），隨心率和 QT間期變化而矯正得到 Tp-Te（corrected）＝QTc×（Tp-Te）／QT，rTp-Te＝（Tp-Te／QT）×100%。對于發(fā)生 TdP的離體心臟：在給藥前及TdP發(fā)生前分別從心電圖中連續(xù)量取5個心動周期的 RR、QT、Tp-Te，并取平均值；對于未發(fā)生TdP的離體心臟：在給藥前及給藥后60min分別從心電圖中連續(xù)量取5個心動周期的RR、QT、Tp-Te，并取平均值。

1.7.3 QT間期不穩(wěn)定性 在給藥前及TdP發(fā)生前分別連續(xù)量取31個心動周期的QT間期進行計算，得到總不穩(wěn)定性（total instability，TI），并通過重心計算短期不穩(wěn)定性（short-term instability，STI）和長期不穩(wěn)定性（long-term instability，LTI），隨后分別計算給藥前后 TI、STI、LTI變化的差值。

1.8 給藥方式

1.9 統(tǒng)計學處理

運用AcqKnowledge 4.1軟件分析處理記錄的心電圖，運用Origin Pro 8.0繪圖。計量資料以均數(shù)±標準誤（）表示，運用 SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組間比較采用配對 t檢驗或單因素方差分析，方差齊時，多組間比較采用LSD法、SNK法；方差不齊時，采用Dunnett T3法。

2 結(jié)果

2.1 TdP模型的建立

本實驗使用 IKs（slowly activated delayed rectifier potassium current）阻滯劑 Chromanol 293B（10μmol／L）合并低鉀（1.8 mmol／L）建立豚鼠離體心臟 TdP模型。如圖1顯示，建立模型過程中可見豚鼠離體心臟離散度增大，增加P-on-T樣早后除極。TdP誘發(fā)率約 85.7%（圖 2），發(fā)生時間為 39.83±7.81 min。因此，使用本法TdP發(fā)生率高，發(fā)生時間較穩(wěn)定，表明模型制備成功，可用于后續(xù)實驗。

Fig.1 Recording of the ECG when TdP occurred in isolated guinea pig heartECG：Electrocardiogram；TdP：Torsades de pointes

2.2 TMCC可降低TdP發(fā)生率

TdP模型成功建立后，觀察TMCC對該模型的影響。待豚鼠離體心臟灌流穩(wěn)定后，在開始造模的同時給予不同濃度的TMCC。如圖2所示，TdP模型組 TdP發(fā)生率為 85.7%。1、2mmol／L TMCC可降低TdP發(fā)生率，TdP發(fā)生率分別為83.3%和16.7%。在TdP模型+4mmol／L TMCC組中，6例豚鼠離體心臟均未發(fā)生TdP。

2.3 TMCC可降低TdP模型增大的復(fù)極離散度

如表1所示，與給藥前相比，TdP模型組Tp-Te、rTp-Te、Tp-Te（corrected）分別增加 68.1%、64.9%和61.4%（P＜0.01）。與各自給藥前相比：TdP模型 +1mmol／L TMCC組 Tp-Te、rTp-Te、Tp-Te（corrected）分別增加 10.5%、3.1%、2.0%（P＞0.05），TdP模型 +2 mmol／L TMCC組 Tp-Te、rTp-Te、Tp-Te（corrected）分別增加 62.1%（P＜0.05）、35.8%和 35.2%（P＞0.05），TdP模型 +4 mmol／L TMCC組 Tp-Te、rTp-Te、Tp-Te（corrected）分別增加 50.6%（P＜0.05）、24.1%、20.0%（P＞0.05）。

Fig.2 Incidence of TdP in each group of isolated guinea pig heartsTMCC：Taurine magnesium coordination compound；TdP：Torsades de pointes

2.4 TMCC可降低TdP模型增大的QT間期不穩(wěn)定性

不穩(wěn)定性的計算對于預(yù)測尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速（torsades de pointes，TdP）／室顫（ventricular fibrillation，VF）的發(fā)生具有重要意義。如圖3所示，將各組中每一只離體豚鼠心臟給藥前后的不穩(wěn)定性數(shù)據(jù)作差值計算后進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，與TdP模型組QT間期總不穩(wěn)性（4.53±0.75）比較，TdP模型 +1 mmol／L TMCC組、TdP模型 +2 mmol／L TMCC組和TdP模型+4 mmol／L TMCC組的QT間期總不穩(wěn)性降低，分別為 3.62±0.88（P＞0.05），1.38±0.36（P＜0.05）和 2.33±0.26（P＜0.05）。

Tab.1 Effects of TMCC on the increased Tp-Te、rTp-Te、Tp-Te（corrected）in TdPmodel of isolated guinea pigheart（，n＝6）

Tab.1 Effects of TMCC on the increased Tp-Te、rTp-Te、Tp-Te（corrected）in TdPmodel of isolated guinea pigheart（，n＝6）

TMCC：Taurine-magnesium coordination compound；TdP：Torsades de pointes*P＜0.05，**P＜0.01 vs Pre-drug group

Groups Drug given Tp-Te（ms） rTp-Te（%） Tp-Te（corrected）（ms ）TdPmodel Pre- 54.20±4.18 30.51±2.30 58.90±4.71 Post- 91.14±5.97** 50.31±2.03** 95.06±4.50**TdPmodel+1mmol／L TMCC Pre- 52.94±3.06 31.70±2.20 60.33±3.80 Post- 58.49±6.01 32.69±2.81 61.53±5.42 TdPmodel+2 mmol／L TMCC Pre- 50.70±4.08 30.43±2.67 58.61±4.35 Post- 82.17±7.38* 41.32±3.80 79.24±6.83 TdPmodel+4mmol／L TMCC Pre- 55.49±5.23 32.71±2.94 64.12±5.41 Post- 83.57±10.58*40.58±6.43 76.95±8.64

Fig.3 The difference between pre-and post-drug in each group（，n＝6）

3 討論

本實驗首先建立豚鼠離體心臟TdP模型。在前期實驗中，我們首先使用 IKs通道阻滯劑 Chromanol 293B［9］建立TdP模型，但未見發(fā)生心律失常；隨后使用IKs通道阻滯劑 Chromanol 293B合并低鉀［10］成功導致離體心臟發(fā)生TdP。有文獻報道，復(fù)極離散度（Tp-Te）大于 90 ms易發(fā)生心律失常［3，11］。我們單獨使用Chromanol 293B雖然可見離散度增大，但其增大程度遠遠小于90 ms。而使用Chromanol 293B合并低鉀建立模型過程中可見離散度大于90ms，有的甚至大于100ms。所以，使用IKs通道阻滯劑Chromanol 293B合并低鉀較為成功的導致心臟發(fā)生TdP，TdP發(fā)生率高。

目前認為，藥源性TdP的發(fā)生機制主要涉及兩方面［12］，一是藥物引起心室肌細胞 APD（action potential duration）延長，但是由于心肌內(nèi)、中、外3層心室肌細胞離子通道的種類和數(shù)量存在差異，造成不均一延長，使得3層心室肌細胞本身存在的異質(zhì)性進一步增大，一部分細胞先完成復(fù)極，這些心室肌細胞會繼續(xù)接受來自相鄰細胞的興奮傳導，從而形成折返，這是維持TdP發(fā)作的機制。本實驗結(jié)果顯示，在建立模型過程中可見離體心臟復(fù)極離散度顯著增大，表明Chromanol 293B合并低鉀使得心臟心室肌的異質(zhì)性顯著增大，易形成折返。而在造模的同時給予一定濃度TMCC，則可減弱TdP模型導致的離散度增大，從而發(fā)揮抗TdP作用。

另一方面則涉及TdP的啟動機制，動作電位中復(fù)極的2相與3相涉及多種離子通道的共同參與，在動作電位跨膜復(fù)極電位正常時，本身就存在一個低幅的震蕩電位。當某些離子通道功能出現(xiàn)變化，如鉀離子外流減少或鈣、鈉離子內(nèi)流增多時，可使震蕩電位的振幅升高，達到除極的閾電位就將形成一次新的除極活動，即早后除極，在心電圖上表現(xiàn)為室性早搏。早后除極形成觸發(fā)活動，啟動TdP的發(fā)生［13-16］。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，在 Chromanol 293B合并低鉀建立模型過程中，離體心臟心電圖會連續(xù)出現(xiàn)P波消失的現(xiàn)象，而TdP模型+TMCC組的離體心臟心電圖則始終有獨立的 P波（圖4）。這表明TMCC可抑制Chromanol 293B合并低鉀導致的早后除極，從而發(fā)揮抗TdP啟動的作用。

Fig.4 ECG waves of an isolated guinea pig heart

除觀測離散度的變化外，近年來有人提出一種新的評價指標——心室復(fù)極不穩(wěn)定性，即QT間期不穩(wěn)定性。這個指標反映心律失常前連續(xù)30個心動周期的QT間期的變化。在計算分析心室復(fù)極不穩(wěn)定性過程中，本文采用的是 van der Linde H［17］等研究報道的計算方法，首先計算30個坐標點的橫縱坐標數(shù)據(jù)的平均值并將其作為重心，繼而計算每個坐標點與該重心點的距離并將其作為心室復(fù)極總不穩(wěn)定性TI，然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)利用該重心點并經(jīng)過推導計算出短期不穩(wěn)定性STI和長期不穩(wěn)定性LTI。該方法始終將30個坐標點的共有聯(lián)系即重心納入計算公式中，能體現(xiàn)出單個數(shù)據(jù)與總體數(shù)據(jù)中心的離散性。實驗表明，造模過程中Chromanol 293B合并低鉀使心臟QT間期不穩(wěn)定性顯著增大，而在造模的同時給予一定濃度TMCC，離體心臟QT間期不穩(wěn)定性顯著降低。

綜上所述，通過探索和實驗最終成功建立豚鼠離體心臟TdP模型，繼而研究、探索了TMCC的抗TdP作用。TMCC可通過降低TdP模型導致的離體心臟跨室壁復(fù)極離散度增加、抑制早后除極的發(fā)生以及降低QT間期不穩(wěn)定性增大而發(fā)揮抗TdP作用，降低TdP發(fā)生率。根據(jù)TdP的發(fā)生機制，在TMCC對具體相關(guān)離子通道的影響方面，將開展更為深入的研究，為臨床治療TdP提供新的思路。

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