紅椿快繁技術(shù)研究

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(1.樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 四川 樂(lè)山 614000；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院電氣信息工程學(xué)院， 河南 鄭州 450002)

紅椿(ToonaCiliataM.Roem)，別名紅楝子、香鈴子，為楝科、香椿屬落葉或半常綠喬木。紅椿為中國(guó)珍貴用材樹(shù)種之一，有“中國(guó)桃花心木”之稱。國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物(國(guó)務(wù)院1999年8月4日批準(zhǔn))[1-2]。紅椿在我國(guó)分布不廣，且呈天然零星分布，但發(fā)展?jié)摿艽?，目前已成為我?guó)南方低山地區(qū)重要的速生用材，造林樹(shù)種和營(yíng)造針闊混交林進(jìn)行樹(shù)種結(jié)構(gòu)調(diào)整的首選樹(shù)種之一[3-4]。

紅椿最常見(jiàn)的繁殖方法是以種子繁殖，但是種子無(wú)法長(zhǎng)期保存，很容易喪失發(fā)芽力[5]。陳麗文等[6]以紅椿種子為外植體初步研究了紅椿的快繁體系，劉均利等[7]研究了紅椿莖段的組織培養(yǎng)。目前關(guān)于紅椿組織快繁方面的研究還非常少見(jiàn)。本試驗(yàn)以種子為材料，建立了無(wú)性苗的快繁體系，以期為該珍貴用材樹(shù)種的天然資源保護(hù)與產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014年11月在樂(lè)山市沙灣區(qū)軫溪鄉(xiāng)，選擇10～15年生、生長(zhǎng)健壯、樹(shù)干通直圓滿、無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良紅椿母樹(shù)上采集當(dāng)年成熟的種子。紅椿種子采回后晾曬數(shù)日后，蒴果自然開(kāi)裂后脫出種子，置于密封塑料袋中在-4 ℃低溫環(huán)境貯藏。取適量粒大、飽滿、性狀完好的紅椿種子，用37 ℃的溫水將種子浸泡4～6 h，然后用75%的乙醇溶液浸泡10 s后無(wú)菌水沖洗3次，之后再用0.1%的升汞溶液浸泡消毒8 min，再用無(wú)菌水沖洗3次。最后將已經(jīng)消毒過(guò)的種子接種到1/2 MS+20 mg/L GA3培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。待紅椿幼苗高10～15 cm時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)材料備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不定芽誘導(dǎo)再生培養(yǎng)試驗(yàn)

取長(zhǎng)勢(shì)良好的初代無(wú)菌培養(yǎng)苗，轉(zhuǎn)接至不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的MS培養(yǎng)基上。每處理45瓶，每瓶接種1個(gè)。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)再生不定芽數(shù)量, 篩選紅椿最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.2 增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

基本培養(yǎng)基為MS、1/2 MS、改良1/2 MS，將再生的無(wú)菌不定芽接種到不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。每處理45瓶，每瓶接種1個(gè)。30 d后統(tǒng)計(jì)增殖情況。

1.2.3 生根培養(yǎng)試驗(yàn)

將長(zhǎng)2～3 cm、生長(zhǎng)健壯的增殖芽切下，接種在附加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。每處理45瓶，每瓶接種1個(gè)，培養(yǎng)30 d后觀察生根狀況，調(diào)查生根率、平均每株生根數(shù)、平均根長(zhǎng)以及平均根粗。

1.2.4 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基均附加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，pH值5.5～6.0。培養(yǎng)室溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間10 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

紅椿外植體消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)很容易發(fā)生褐變現(xiàn)象，消毒時(shí)間過(guò)短又污染嚴(yán)重，經(jīng)過(guò)預(yù)備實(shí)驗(yàn)篩選，折中選擇了0.1%的升汞溶液浸泡消毒8 min的處理時(shí)間，初代培養(yǎng)的平均污染率為5.74%。初代培養(yǎng)得到的外植體接種在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30 d后觀察再生情況(平均污染率為3.51%)。外植體接種后，10 d左右可見(jiàn)明顯的愈傷組織產(chǎn)生，15 d左右即可看見(jiàn)腋芽萌發(fā)，部分愈傷處有叢芽產(chǎn)生，30 d后小苗高2～3.5 cm。結(jié)果如表1所示，處理A 6(MS+1 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA)誘導(dǎo)率最高，為85%。6-BA濃度再升高后，雖然誘導(dǎo)率也比較高，但是更容易在愈傷組織上分化細(xì)弱的小苗甚至玻璃苗，后期增殖培養(yǎng)常出現(xiàn)嚴(yán)重的褐變現(xiàn)象。從表2可看出，6-BA對(duì)紅椿的不定芽誘導(dǎo)有顯著影響，NAA對(duì)其誘導(dǎo)沒(méi)有顯著影響。

表1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)紅椿不定芽誘導(dǎo)的影響

處理號(hào)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度(mg/L)6-BANAA接種數(shù)(個(gè))誘導(dǎo)率(%)A10.50.054545.11A20.50.14560.13A30.50.154555.67A410.054575.02A510.14577.13A610.154585.56A71.50.054569.22A81.50.14555.11A91.50.154552.13A1020.054577.78A1120.14575.22A1220.154564.02

注：污染苗不計(jì)。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)紅椿不定芽誘導(dǎo)的方差分析

差異源SSdfMSFP-valueF crit6-BA1256.9173418.97226.0307880.0304574.757063NAA18.529.250.1331470.8778535.143253誤差416.8333669.47222總計(jì)1692.2511

2.2 增殖培養(yǎng)

當(dāng)誘導(dǎo)不定芽長(zhǎng)到2.5 cm 左右時(shí)，可以接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。一般培養(yǎng)15～20 d可見(jiàn)有增殖小苗出現(xiàn)，但是增殖系數(shù)普遍不高。每株外植體平均只分化出3.5株小苗，而且有部分小苗玻璃化嚴(yán)重，難以用于生根培養(yǎng)。從結(jié)果來(lái)看，在增殖過(guò)程中，其影響因素從大到小依次為：培養(yǎng)基類型>6-BA>NAA>KT。培養(yǎng)基類型對(duì)增殖系數(shù)有顯著影響，最佳的增殖培養(yǎng)基是改良1/2 MS，其增殖系數(shù)平均為5.2。處理B 8的增殖系數(shù)最高，但是玻璃化較為嚴(yán)重，從增殖苗的有效性分析，最佳的增殖處理為B 7，即改良1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+1.0 mg/L KT。

表3 不同處理對(duì)紅椿不定芽增殖系數(shù)的影響

處理號(hào)培養(yǎng)基6-BA(mg/L)NAA(mg/L)KT(mg/L)增殖系數(shù)B11(MS)1(0.5)1(0.05)1(0)1B212(1.0)2(0.1)2(1)1.3B313(1.5)3(0.15)3(2)1.5B42(1/2MS)1232.5B522315.8B623124B73(改良1/2MS)1325.7B832137.6B933212.4極差3.9662.2672.2060.8

2.3 生根培養(yǎng)

繼代苗生長(zhǎng)約25 d，長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，取出在生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。外植體在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后部分試管苗有根芽出現(xiàn)，生長(zhǎng)緩慢；培養(yǎng)20 d后根可以長(zhǎng)到3.0～5.0 cm，根數(shù)2～5條，生長(zhǎng)迅速。從表4可以看出，添加IAA和NAA后紅椿的生根率有一定的提高，隨著IAA或NAA濃度的升高，生根率均有不同程度的提高，但都沒(méi)達(dá)到極顯著水平。當(dāng)濃度升高到1.0 mg/L時(shí)，平均生根數(shù)有顯著的增加，且添加IAA的培養(yǎng)基生根數(shù)比NAA更多，但是較為纖細(xì)，不利于移栽成活。綜合生根率與根系強(qiáng)壯程度，最佳的生根培養(yǎng)基為C 3，即1/2 MS+1.0 mg/L NAA。

表4 不同處理對(duì)紅椿組培苗生根的影響

處理號(hào)IAA(mg/L)NAA(mg/L)生根率(%)平均生根數(shù)(條)C10078.3c3.5bC200.590.3ab4.3bC301.098.5a6.9aC40.5087.2b4.6bC51.0093.3a7.3a

3 討論與結(jié)論

3.1 結(jié) 論

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅椿適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，誘導(dǎo)率為85.56%；最佳的增殖培養(yǎng)基為改良1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L

NAA+1.0 mg/L KT，增殖系數(shù)為5.7；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L NAA，生根率為98.5%。

3.2 討 論

紅椿組培苗在培養(yǎng)過(guò)程中，種子在添加了GA3的1/2 MS培養(yǎng)基上可以很快萌芽長(zhǎng)成10～15 cm的小苗。利用無(wú)菌小苗作為外植體來(lái)進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)可以大大降低褐變率，提高誘導(dǎo)成功率。

適當(dāng)?shù)?-BA濃度對(duì)紅椿誘導(dǎo)成功率有很大影響，高濃度的6-BA可以很快誘導(dǎo)分化出大量的叢生小芽，但是玻璃化較為嚴(yán)重，培養(yǎng)后期褐變現(xiàn)象也很?chē)?yán)重，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MS+1 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA是最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為85%。

快速增殖、成苗健康是組培成功工廠化的重要因素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基和6-BA對(duì)增殖效率有顯著影響，培養(yǎng)基的C源濃度可能是叢芽增殖的重要影響因素。在改良1/2 MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，添加適量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能夠快速增加增殖系數(shù)，同時(shí)有效的抑制褐變，改良1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+1.0 mg/L KT的增殖效果最好，是適宜的增殖培養(yǎng)基。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是紅椿組培苗生根的重要影響因素，直觀來(lái)看，NAA比IAA的生根效果更好。但是實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的情況下紅椿組培苗的生根率仍然較高，且根系比較健康粗壯。在后期的實(shí)驗(yàn)中可以考慮不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，以降低成本，簡(jiǎn)化流程。

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