重慶市部分養(yǎng)殖場金黃色葡萄球菌耐藥性分析及ESBL基因檢測

陳 瑤，丁紅雷，何 英，牟 豪，王立敏，王豪舉

(西南大學(xué)獸醫(yī)傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種重要的人畜共患病病原菌，廣泛存在于動物和人的呼吸道、消化道、體表等部位。金黃色葡萄球菌有多種感染途徑，不同感染途徑導(dǎo)致的臨床癥狀也不同。在獸醫(yī)臨床上常造成乳房炎、關(guān)節(jié)炎、臍炎、局部膿腫等疾??；也可引起人的皮膚化膿和敗血癥，其產(chǎn)生的腸毒素是造成人類食物中毒的一大元兇[1]。自1961年K. R. Eriksen[2]檢出第一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)開始，關(guān)于金黃色葡萄球菌對各種抗菌藥物耐藥的報道越來越頻繁，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)耐環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萬古霉素等的耐藥菌株[3-4]，特別是多重耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重[5]，由此造成的一系列公共衛(wèi)生問題已成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是一種能夠水解青霉素，第一、第二、第三代和部分第四代頭孢菌素類抗生素和氨曲南，其活性又能夠被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸)抑制的酶類。多種ESBL基因編碼的蛋白均具有ESBLs活性。除TEM-12由染色體介導(dǎo)外，其余ESBL基因由質(zhì)粒介導(dǎo)。目前世界各地發(fā)現(xiàn)的ESBL基因已經(jīng)超過200種[6]。ESBL基因常常存在于革蘭陰性菌，如大腸桿菌和克雷伯菌，目前尚未見金黃色葡萄球菌攜帶ESBL基因的報道。

本研究分離了重慶市部分養(yǎng)殖場中的金黃色葡萄球菌，測定了其對多種藥物的耐藥性，并檢測了菌株中是否攜帶ESBL基因，為了解重慶市動物源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌菌株ATCC 25923和分離菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基、Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司，溶菌酶購自BBI生命科學(xué)有限公司，溶葡菌素購自Biosharp公司，PrimeSTAR?Max DNA Polymerase購自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.1.3 藥敏試紙片 24種抗生素藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和處理

1.2.1.1 樣品采集: 所有樣品于2014.03-2017.12采集于重慶市的部分牛、雞、山羊、豬和兔養(yǎng)殖場。采集的所有樣品均置于有冰袋的泡沫箱中，6 h之內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。共采集樣品1 371份。

1.2.1.2 樣品處理: 樣品經(jīng)增菌后，將菌液或膿汁劃線接種于甘露醇氯化鈉平板，37 ℃培養(yǎng)20 h后置于4 ℃ 3～4 d。每個平板挑取3～5個淺黃色、黃色或橙色疑似金黃色葡萄球菌菌落劃線于LB平板，37 ℃培養(yǎng)20 h。挑取單個菌落，革蘭染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2 臨床菌株的PCR檢測

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成: 根據(jù)GenBank中公布的金黃色葡萄球菌nuc基因序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物nuc-F：5′-AGGGATGGCTATCAGTAATGTTTC-3′和nuc-R：5′-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCAC-3′。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.2.2 分離菌株的PCR鑒定：水煮法提取菌液DNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 10 μL，nuc-F(10 μmol·L-1)0.5 μL，nuc-R(10 μmol·L-1)0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為陽性對照。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B紙片法對金黃色葡萄球菌臨床分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株。

1.2.4 金黃色葡萄球菌ESBL基因檢測

1.2.4.1 質(zhì)粒的提?。喝? mL菌液，12 000 r·min-1室溫離心1 min，棄上清，加入250 μL solution Ⅰ重懸后加入終質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1的溶葡菌素和10 μg·mL-1的溶菌酶，37 ℃反應(yīng)至液體澄清后，按照試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

1.2.4.2 ESBL基因的PCR擴(kuò)增：以提取的質(zhì)粒為模板，使用PrimeSTAR?Max DNA Polymerase PCR擴(kuò)增8個ESBL基因，包括blaTEM[7]F-5′-TCCGCTCATGAGACAATAACC-3′, R-5′-TTGGTCTGACAGTTACCAATGC-3′，退火溫度55 ℃、blaCTX-M[7]F-5′-TCTTCCAGAATAAGGAATCCC-3′，R-5′-CCGT-TTCCGCTATTACAAAC-3′，退火溫度50 ℃、blaSHV[8]F-5′-TGGTTATGCGTTATATTCGCC-3′，R-5′-GGTTA-GCGTTGCCAGTGCT-3′，退火溫度61 ℃、blaOXA-2[9]F-5′-AAGAAACGCTACTCGCCTGC-3′，R-5′-CCAC-TCAACCCATCCTACCC-3′，退火溫度58 ℃、blaOXA-10[10]F-5′-GTCTTTCGAGTACGGCATTA-3′，R-5′-ATTTTCTTAGCGGCAACTTAC-3′，退火溫度53 ℃、blaVEB[11]F-5′-GATAGGAGTACAGACATA-TG-3′，R-5′-TTTATTCAAATAGTAATTCCACG-3′，退火溫度47 ℃、blaPER[12]F-5′-ATGAATGTCATCACAAAATG-3′，R-5′-TCAATCCGGACTCACT-3′，退火溫度49 ℃和blaGES[13]F-5′-ATGCGCTTCATTCACGCAC-3′，R-5′-CTATTTGTCCGTGCTCAGG-3′，退火溫度55 ℃，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對后進(jìn)行基因分型。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離

本研究在1 371份樣品中，通過選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)和增菌，并通過PCR鑒定共分離到金黃色葡萄球菌89株(圖1)，分離率為6.5%(表1)。其中在牛、豬、雞、羊和兔場各分離到6株(1.7%)、25株(7.3%)、32株(6.7%)、10株(11.4%)、16株(15.2%)菌株。兔場的分離率最高，其次為羊場、豬場、雞場，奶牛場的分離率最低。

M. 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker Ⅲ；1. ATCC25923；2～23. 臨床分離菌株；24. ddH2OM. Marker Ⅲ; 1. ATCC25923; 2-23. Isolates; 24. ddH2O圖1 金黃色葡萄球菌特異性nuc基因的檢測Fig.1 Detection of S. aureus specific nuc gene

表1 金黃色葡萄球菌菌株分離鑒定情況Table 1 Isolation and identification of S. aureus strains from different animals

2.2 藥物敏感性

89株金黃色葡萄球菌臨床分離株對24種抗菌藥物的敏感性結(jié)果見表2。分離菌株對青霉素類藥物耐藥最為嚴(yán)重，其次為四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類。

從菌株來源來看，豬源和雞源菌株的耐藥情況較羊源、牛源和兔源菌株嚴(yán)重。

表2 金黃色葡萄球菌臨床分離株的藥物敏感性Table 2 Antimicrobial susceptibility of S. aureus isolates

(轉(zhuǎn)下頁Carried forward)

(續(xù)表2 Continued)

R/S/I.耐藥/敏感/中介
R/S/I.Resistant/Sensitive/Intermediate;DRR. Drug-resistant rate

由圖2可見，不同動物來源菌株和同一動物來源不同菌株對所測定藥物的耐藥數(shù)量不同。最高的1株豬源菌株耐21種藥物，最低的2株兔源菌株耐1種藥物，耐15種及以上藥物的菌株有15株，占總菌株數(shù)的16.8%。豬源菌株中耐16種及以上藥物的有12株，占豬源菌株數(shù)的48%。雞源菌株的耐藥數(shù)為2～18種不等；牛源菌株有5株耐5種及以下藥物，1株菌耐11種藥物；羊源菌株的耐藥數(shù)為2～10種不等；兔源菌株耐藥數(shù)為2～9種不等。

2.3 ESBL基因檢測及分型

通過對blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaOXA-2、blaOXA-10、blaVEB、blaPER和blaGES8個ESBL基因的PCR檢測發(fā)現(xiàn)，只有blaTEM基因能被擴(kuò)增出來(圖3)，該基因存在于86株臨床分離菌株，占所有分離菌株的96.6%。通過BLAST序列比對分析，所有86個blaTEM基因均為TEM-1a基因型。

圖2 金黃色葡萄球菌臨床分離株的多重耐藥情況Fig.2 The number of multidrug-resistance S. aureus isolates

M. 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker Ⅲ；1～24. 臨床分離菌株M. Marker Ⅲ; 1-24. Clinical isolates圖3 blaTEM基因PCR擴(kuò)增Fig.3 Amplification of blaTEM gene by PCR

3 討 論

金黃色葡萄球菌是自然界、人和動物的體表、消化道、呼吸道廣泛存在的細(xì)菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低、環(huán)境條件惡劣、體表或外科手術(shù)創(chuàng)面暴露時，金黃色葡萄球菌可乘機(jī)感染這些部位。由于金黃色葡萄球菌可能造成廣泛的感染，在人和獸醫(yī)臨床上通常使用抗菌藥物來預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌感染，這也造成了金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的廣泛耐藥，如對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等耐藥，特別是MRSA菌株在人源和動物源性菌株的廣泛存在[14-15]，除此之外，在一些國家還分離到了動物源性耐萬古霉素金黃色葡萄球菌[16]。

在中國，金黃色葡萄球菌特別是MRSA不僅成為醫(yī)院和社區(qū)感染的重要病原菌，也是造成畜牧業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的重要病原之一，耐藥金黃色葡萄球菌通過食物鏈向人的傳播成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。關(guān)于動物源性金黃色葡萄球菌耐藥的報道呈逐年上升趨勢，但對重慶市金黃色葡萄球菌的耐藥情況還知之甚少。本研究在重慶市部分養(yǎng)殖場隨機(jī)采樣分離到了89株金黃色葡萄球菌，這些菌株分離自牛、豬、雞、山羊和兔。牛源菌株的分離率較低，這可能是由于金黃色葡萄球菌不是引起重慶地區(qū)奶牛乳房炎的主要病原，因?yàn)楸狙芯坎杉呐Ｄ坛^三分之一存在乳房炎。

從耐藥情況來看，分離菌株對青霉素類藥物嚴(yán)重耐藥，對四環(huán)素類藥物耐藥也較為嚴(yán)重，對大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、酰胺醇類、林可胺類、喹諾酮類、磺胺類藥物也存在不同程度的耐藥，這可能與養(yǎng)殖場在飼料和飲水中添加此類藥物作為日常預(yù)防用藥有關(guān)，也與部分養(yǎng)殖場經(jīng)常使用抗生素有關(guān)。山羊和家兔養(yǎng)殖中一般不在飼料和飲水中添加預(yù)防性抗菌藥物，這可能是羊源和兔源菌株的耐藥率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他來源菌株的重要原因。

本研究分離的多重耐藥菌株極為常見，特別是豬源多重耐藥菌株，這與在養(yǎng)豬生產(chǎn)中抗菌藥物的使用最為頻繁有關(guān)。羊源和兔源菌株多重耐藥情況較輕微，在養(yǎng)羊及養(yǎng)兔生產(chǎn)中，由于其細(xì)菌性疾病的發(fā)病率一般低于豬、牛和雞，因此一般很少在飼料和飲水中添加抗菌藥物，用于治療的頻率也低于上述兩種動物，因此羊源和兔源菌株的多重耐藥情況遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于豬源和雞源菌株。

本研究分離的菌株對青霉素類和頭孢菌素類藥物廣泛耐藥，說明這些菌株可能為產(chǎn)ESBLs金黃色葡萄球菌。目前CSLI沒有金黃色葡萄球菌ESBLs篩選和確證試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，故未進(jìn)行金黃色葡萄球菌ESBLs表型篩選和確證。但這些菌株可能攜帶ESBL基因，故檢測了8個大類的ESBL基因。檢測的ESBL基因經(jīng)BLAST序列比對，均為blaTEM-1a基因，說明在重慶市分離的動物源性金黃色葡萄球菌中blaTEM-1a基因型流行比較廣泛。在今后的研究中，還要加強(qiáng)對重慶地區(qū)金黃色葡萄球菌人源菌株和其他地區(qū)菌株中ESBL基因的檢測，以明確金黃色葡萄球菌主要攜帶的ESBL基因的基因型。

4 結(jié) 論

通過對重慶不同畜禽養(yǎng)殖場金黃色葡萄球菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，初步分析重慶市不同動物來源的金黃色葡萄球菌的耐藥規(guī)律，對臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義。同時通過對金黃色葡萄球菌中ESBL基因的檢測，發(fā)現(xiàn)了ESBLs在金黃色葡萄球菌中的流行，且廣泛存在blaTEM-1a基因型。

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