不同時(shí)間異氟醚麻醉對(duì)幼齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及自噬的影響

邱子豪，胡學(xué)遠(yuǎn)，馮秀晶，趙 元，宋曼玉，王超然，劉 濤，范宏剛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

研究證實(shí)，快速生長發(fā)育期間，大腦特別容易受到外界因素的損傷，在此期間單次或多次暴露于麻醉藥能夠顯著引起大腦廣泛的神經(jīng)元凋亡(apoptosis)，并伴隨腦功能的長期性損害[1]。2013年，在英國麻醉學(xué)雜志舉辦研討會(huì)上專家也曾就麻醉神經(jīng)毒性進(jìn)行了深入的探討，并指出機(jī)體暴露于麻醉藥的時(shí)期(年齡，時(shí)長)和暴露于麻醉藥的深度(包括次數(shù)和劑量)，是造成快速生長發(fā)育期神經(jīng)毒性的重要因素[2]。細(xì)胞自噬(autophagy)是指某些需降解的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器等細(xì)胞質(zhì)成分被包裹，并最終被運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行降解的過程。在正常情況下，自噬的主要作用是對(duì)受損細(xì)胞器進(jìn)行降解，從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用，是細(xì)胞為了適應(yīng)內(nèi)、外界環(huán)境變化的一種自我保護(hù)反應(yīng)[3]。相關(guān)的研究還發(fā)現(xiàn)，在某些相同因素誘導(dǎo)下，細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡可先后出現(xiàn)或同時(shí)存在于同一細(xì)胞中，表現(xiàn)的作用是相互促進(jìn)或互相拮抗[4]。在病理狀態(tài)早期，自噬起到的是保護(hù)作用，能及時(shí)清除受損的細(xì)胞器和蛋白以促進(jìn)物質(zhì)、能量的循環(huán)利用及維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[5]；而到病理狀態(tài)晚期，自噬已不能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞器被大量降解必然導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡[6]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，多次注射低劑量氯胺酮可以引起成年SD大鼠海馬發(fā)生自噬，并指出自噬的增強(qiáng)是對(duì)氯胺酮毒性作用的保護(hù)性反應(yīng)[7]，提示全麻藥物可引起海馬神經(jīng)元自噬，且自噬的發(fā)生可能是種保護(hù)作用。另有研究表明，骨骼肌細(xì)胞暴露于全身麻醉藥巴比妥鈉或異氟醚后均可以引起自噬水平的增強(qiáng)；且在相同時(shí)長下，麻醉藥濃度越高越容易引起自噬[8]。還有學(xué)者指出，20月齡的老齡SD大鼠，在經(jīng)歷1.5%異氟醚麻醉4 h后，可以顯著性引起海馬LC3-II/I表達(dá)增加，同時(shí)水迷宮測(cè)試提示學(xué)習(xí)能力下降，表明異氟醚引起的細(xì)胞自噬可能具有一定的毒性作用[9]。因此，自噬在麻醉過程中究竟起到何種作用還有待進(jìn)一步研究。因此，本試驗(yàn)通過建立異氟醚麻醉模型，探討不同時(shí)間異氟醚麻醉對(duì)幼齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7日齡SD幼鼠(P7)40只，總共4窩，每窩10只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥物與試劑

異氟醚購自深圳瑞沃德有限公司；戊巴比妥鈉購自Sigma(St. Louis, MO)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Caspase-3、LC3 A/B及Beclin-1抗體購自Cell Signaling Technology公司；Bcl-2、β-actin、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體及SV超敏兩步法組化試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒等購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立和樣品采集 40只P7幼鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和1.5%異氟醚麻醉2、3、4、6 h組(n=8)，建立試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。將大鼠置于自制透明麻醉箱?nèi)，使用加熱墊保持盒內(nèi)溫度在37 ℃左右，以60%空氧混合氣體作為載體給大鼠吸入1.5%的異氟醚。對(duì)照組不進(jìn)行麻醉處理，其他操作步驟與各異氟醚麻醉組相同。使用氣體監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)麻醉箱內(nèi)麻醉氣體以及氧氣的濃度。幼鼠分別于麻醉相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后腹腔注射150 mg·kg-1戊巴比妥鈉處死。安樂死后每組取3只幼鼠用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流，然后取腦，再浸入4%多聚甲醛(pH=7.4)固定，用于石蠟包埋；其余5只迅速取出腦組織，并置于冰盤上用4 ℃中性PBS進(jìn)行沖洗，分離海馬組織，取出后立即放入1.5 mL EP管，并置于液氮迅速冷凍后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 TUNEL染色 1)組織固定后，進(jìn)行常規(guī)脫水及浸蠟，然后進(jìn)行切片，厚度4～6 μm，常規(guī)脫蠟、水合。2)按試劑盒說明書分別將切片浸入蛋白酶K工作液、3% H2O2封閉液、TdT酶反應(yīng)液和Streptavidin-HRP工作液，按要求孵育并漂洗。3)隨機(jī)選2張切片，作為對(duì)照，陽性對(duì)照滴加蛋白酶K工作液后加100 μL DNase I反應(yīng)液；陰性對(duì)照不加TdT酶反應(yīng)液；4)滴加DAB工作液，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，30 s～10 min；PBS中終止反應(yīng)，最后用蘇木素染液復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下在同一參數(shù)下拍照觀察，每一張切片隨機(jī)選取8個(gè)(CA1、CA2、CA3和DG區(qū)各2個(gè))高倍視野(400×)。

1.3.3 LC3-II免疫組化 1)組織固定后，進(jìn)行常規(guī)脫水及浸蠟，然后進(jìn)行切片，厚度4～6 μm；2)切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合后用3% H2O2(現(xiàn)配現(xiàn)用)室溫孵育10 min；3)切片浸入0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液，進(jìn)行高壓熱修復(fù)抗原4 min；4) 切片經(jīng)5% BSA封閉20 min后，滴加LC3 B抗體(1∶400)濕盒中4 ℃孵育過夜；5)樣本漂洗后滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG室溫孵育30 min；6)DAB顯色，室溫鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(5～10 min)，然后用PBS終止顯色，然后用蘇木素染液復(fù)染；光學(xué)顯微鏡下在同一參數(shù)下拍照觀察，每一張切片隨機(jī)選取8個(gè)(CA1、CA2、CA3和DG區(qū)各2個(gè))高倍視野(400×)。

1.3.4 Western blot分析 1)海馬組織加入適量Western及IP細(xì)胞裂解液充分裂解，于4 ℃離心機(jī)12 000 g離心10 min，取上清；2)采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)所分離上清液蛋白濃度；3)參照總蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液和稀釋液后，將樣品總質(zhì)量濃度確定為3 μg·μL-1，煮沸10 min，-80 ℃凍存樣品備用；4)按照SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒說明，分別配制分離膠和濃縮膠，進(jìn)行電泳；5)低溫條件下恒流300 mA進(jìn)行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；6)將轉(zhuǎn)完膜的PVDF膜放入5%脫脂奶粉-TBST封閉液中，37 ℃恒溫?fù)u床封閉90 min；7)用5%脫脂奶粉-TBST分別按β-actin 1∶600，Cleaved-caspase-3 1∶1 000，Bcl-2 1∶500，LC3-II/I 1∶1 200和Beclin-1 1∶800的比例稀釋一抗，混勻，4 ℃孵育過夜；8)分別按β-actin 1∶8 000，Cleaved-caspase-3 1∶4 000，Bcl-2 1∶5 000，LC3-II/I 1∶6 000和Beclin-1 1∶8 000的比例稀釋二抗，37 ℃搖床孵育1.5 h；9)用ECL法對(duì)PVDF膜進(jìn)行目的蛋白發(fā)光檢測(cè)，用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，獲取曝光結(jié)果，Gel-Pro analyzer軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 海馬組織TUNEL染色

不同組別麻醉各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)TUNEL染色結(jié)果(圖1)，光鏡下陽性細(xì)胞顯示核固縮，染色質(zhì)凝聚，呈棕黃色或黃褐色，而陰性細(xì)胞則成淡藍(lán)色。在麻醉2 h時(shí)，可見少量黃褐色深染細(xì)胞核，3、4和6 h時(shí)陽性細(xì)胞逐漸增多，且在4和6 h時(shí)海馬錐體細(xì)胞排列松散，紊亂，說明海馬區(qū)損傷較為嚴(yán)重。

圖1 麻醉各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)TUNEL染色結(jié)果Fig.1 Results of TUNEL-staining at each anesthesia time point in hippocampus CA1 area

2.2 海馬組織 LC3-II免疫組化染色

從圖2可見，不同組別麻醉各時(shí)間點(diǎn)LC3-II表達(dá)結(jié)果，陽性細(xì)胞在光鏡下呈棕黃色或黃褐色，而陰性細(xì)胞則呈淡藍(lán)色。免疫組化結(jié)果顯示，在麻醉2 h時(shí)間點(diǎn)，可見少量黃褐色細(xì)胞核深染，3 h時(shí)陽性細(xì)胞比例最高。

圖2 麻醉各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)LC3-II免疫組化結(jié)果Fig.2 Results of LC3-II immunostaining at each anesthesia time point in hippocampus CA1 area

2.3 凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及Bcl-2的相對(duì)表達(dá)情況

由圖3可知：隨著異氟醚作用時(shí)間的增加，Caspase-3 表達(dá)逐漸增強(qiáng)；與對(duì)照組比較，3、4和6 h組Caspase-3 表達(dá)增強(qiáng)明顯，差異顯著(P<0.05)；與2、3 h組比較，6 h組Caspase-3 表達(dá)增強(qiáng)明顯，差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知：隨著異氟醚作用時(shí)間的增加，Bcl-2表達(dá)量隨著麻醉時(shí)間的延長逐漸下降，其中在3、4和6 h時(shí)與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.4 自噬相關(guān)蛋白LC3-II/I及Beclin-1的相對(duì)表達(dá)情況

隨著異氟醚作用時(shí)間的增加，LC3-II/I表達(dá)量先升高后下降；與對(duì)照組比較，3 h組LC3-II/I表達(dá)增強(qiáng)明顯，差異顯著(P<0.05)；與2 h組比較，3 h 組LC3-II/I表達(dá)增強(qiáng)明顯，差異顯著(P<0.05)；與3 h組比較，4和6 h組LC3-II/I表達(dá)減少明顯，差異顯著(P<0.05)(圖5)。

與對(duì)照組比較，*. P<0.05；與其他麻醉組比較，#. P<0.05。下同Compared with the control group, *. P<0.05; Compared with other anesthesia group, #.P<0.05. The same as below圖3 Caspase-3在幼齡大鼠海馬神經(jīng)元中的表達(dá)量Fig.3 Expression of cleaved-Caspase-3 in hippocampus of young rats

圖4 Bcl-2在幼齡大鼠海馬神經(jīng)元中的表達(dá)量Fig.4 Expression of Bcl-2 in hippocampus of young rats

圖5 LC3-II/I在幼齡大鼠海馬神經(jīng)元中的表達(dá)量Fig.5 Expression of LC3-II/I in hippocampus of young rats

由圖6可見：隨著異氟醚作用時(shí)間的增加，Beclin-1表達(dá)量先上升后下降；與對(duì)照組比較，2、3和4 h組Beclin-1表達(dá)增強(qiáng)明顯，差異顯著(P<0.05)；與2、3和4 h組比較，6 h組Beclin-1表達(dá)減少明顯，差異顯著(P<0.05)。

圖6 Beclin-1在幼齡大鼠海馬神經(jīng)元中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Expression of Beclin-1 in hippocampus of young rats

3 討 論

近年來關(guān)于全麻藥能誘導(dǎo)腦神經(jīng)元凋亡，同時(shí)伴隨腦功能的長期性損害受到了世界各國的廣泛關(guān)注[10-12]。Bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的抗凋亡基因，它具有抑制凋亡的作用[13]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡途徑的最后效應(yīng)子，能夠?qū)е录?xì)胞凋亡[14]。腦內(nèi)的海馬組織是參與學(xué)習(xí)或記憶神經(jīng)回路的重要部分。學(xué)習(xí)記憶的系統(tǒng)中任何環(huán)節(jié)的缺陷都可能損害記憶功能。本試驗(yàn)通過P7幼鼠建立臨床常用濃度的異氟醚麻醉模型來檢測(cè)麻醉藥對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著異氟醚作用時(shí)間的增加，與對(duì)照組相比，活化的Caspase-3表達(dá)量逐漸增加；Bcl-2隨著麻醉時(shí)間的延長逐漸下降。這表明異氟醚能誘導(dǎo)幼年SD大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，并隨著麻醉時(shí)間的加長凋亡水平逐漸升高，這與前人的研究結(jié)果類似[15]。

研究認(rèn)為自噬在細(xì)胞營養(yǎng)缺乏，或者應(yīng)激條件存在時(shí)有效地保護(hù)了細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的自體穩(wěn)態(tài)。LC3和Beclin-1是自噬的特定生物化學(xué)標(biāo)記，正常細(xì)胞中LC3-I和LC3-II均能被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-I會(huì)向LC3-II轉(zhuǎn)化，而使LC3-II表達(dá)升高并牢牢固定在自噬體膜上。一旦自噬體與溶酶體發(fā)生融合，自噬體膜上的LC3-II就會(huì)被溶酶體水解酶降解，因此LC3-II的表達(dá)量可以反映自噬形成和降解之間的平衡關(guān)系。因此，通過檢測(cè)LC3-II/I、Beclin-1 含量變化可判斷自噬活動(dòng)的強(qiáng)度[16]。本研究結(jié)果顯示，隨著異氟醚作用時(shí)間的增加，與對(duì)照組相比，LC3-II/I表達(dá)含量先升高后下降，并且在異氟醚作用3 h時(shí)表達(dá)含量明顯升高；Beclin-1表達(dá)含量也是先升高后下降，在異氟醚作用2、3和4 h時(shí)含量明顯升高，并且在3 h時(shí)升高最明顯。說明在異氟醚的作用下，幼齡SD大鼠海馬神經(jīng)元伴隨著自噬的激活。綜合LC3和Beclin-1的表達(dá)結(jié)果來看，異氟醚麻醉2～4 h后自噬水平顯著提高，其中麻醉3 h自噬水平最高，然后隨著麻醉時(shí)間的延長自噬水平逐漸減弱。但也有研究表明PD7幼齡大鼠接受1.5%異氟醚麻醉6 h不會(huì)引起大腦皮層Beclin-1的表達(dá)升高[17]。而成年小鼠接受1%異氟醚麻醉3 h可以引起成年小鼠皮層顯著自噬，但不會(huì)引起海馬區(qū)自噬的顯著增強(qiáng)[18]。這種與本試驗(yàn)不一致的結(jié)果，可能與麻醉濃度的選擇有關(guān)，也可能與幼齡大鼠在麻醉過程中不同腦區(qū)對(duì)麻醉敏感程度不同有關(guān)。

自噬和凋亡可先后出現(xiàn)或同時(shí)存在，表現(xiàn)出相互促進(jìn)或互相拮抗的作用，并且自噬和凋亡的因子存在著相互影響和交叉。適度的自噬能保護(hù)細(xì)胞免受損傷，而過度的自噬又將加速細(xì)胞死亡，所以自噬的調(diào)控可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在酒精致PC12細(xì)胞損傷過程中，其自噬受到了抑制，Caspase-3 表達(dá)含量升高，而激活自噬則相反。S. Y. Hung等[19]研究指出，增強(qiáng)自噬能抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，增加海馬神經(jīng)元的存活。秀麗隱桿線蟲發(fā)育過程中，Beclin-1下調(diào)引起了Caspase-3依賴的凋亡增加和凋亡細(xì)胞數(shù)目增多[20]。在一些重金屬中毒或缺血缺氧模型中，也發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)淖允煽蓪?duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用[21]。近年來，有關(guān)麻醉藥對(duì)自噬的調(diào)節(jié)也陸續(xù)被報(bào)道[22]，且不同的試驗(yàn)結(jié)果也有一定差異，并且不同異氟醚麻醉時(shí)間點(diǎn)對(duì)自噬及凋亡的影響及自噬在其中發(fā)揮著怎樣的作用還不明確。本研究結(jié)果顯示，隨著異氟醚作用時(shí)間的增加，與對(duì)照組相比，Beclin-1在2、3 h表達(dá)含量明顯升高，而Bcl-2表達(dá)含量逐漸降低；與幼年SD大鼠海馬神經(jīng)元在異氟醚作用3、4 h相比，在6 h時(shí)Beclin-1表達(dá)含量明顯下降，而Caspase-3表達(dá)含量明顯升高。通過結(jié)果推斷，異氟醚能夠誘發(fā)幼年SD大鼠海馬神經(jīng)元自噬的活化，進(jìn)而起到抑制凋亡的作用；而異氟醚引起的自噬不能逆轉(zhuǎn)異氟醚導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡，或過高凋亡抑制幼年SD大鼠海馬神經(jīng)元自噬的活化，而使神經(jīng)元最終凋亡。

4 結(jié) 論

異氟醚不僅可以引起幼齡SD大鼠海馬神經(jīng)元廣泛凋亡，而且還能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元自噬，但凋亡水平隨麻醉時(shí)間延長逐漸加強(qiáng)，而自噬水平先升高后降低。自噬在異氟醚誘導(dǎo)的海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡中可能發(fā)揮著保護(hù)性作用。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] 張建峰, 馬 莉. 全麻藥對(duì)幼齡動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J]. 國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志, 2013, 34(2): 171-176.

ZHANG J F, MA L. Effects of general anesthetics on neuroapoptosis in infant animal’s brain[J].InternationalJournalofAnesthesiologyandResuscitation, 2013, 34(2): 171-176. (in Chinese)

[2] JEVTOVIC-TODOROVIC V, ABSALOM A R, BLOMGREN K, et al. Anaesthetic neurotoxicity and neuroplasticity: An expert group report and statement based on the BJA Salzburg Seminar[J].BrJAnaesth, 2013, 111(2): 143-151.

[3] YANG Z F, KLIONSKY D J. Eaten alive: A history of macroautophagy[J].NatCellBiol, 2010, 12(9): 814-822.

[4] XUE L Z, FLETCHER G C, TOLKOVSKY A M. Autophagy is activated by apoptotic signalling in sympathetic neurons: An alternative mechanism of death execution[J].MolCellNeurosci, 1999, 14(3): 180-198.

[5] ZHAO D X, YUAN H P, YI F, et al. Autophagy prevents doxorubicin-induced apoptosis in osteosarcoma[J].MolMedRep, 2014, 9(5): 1975-1981.

[6] JIANG Q, LI F, SHI K J, et al. ATF4 activation by the p38MAPK-eIF4E axis mediates apoptosis and autophagy induced by selenite in Jurkat cells[J].FEBSLett, 2013, 587(15): 2420-2429.

[7] 張 陽, 曹甲甲, 陸俊龍, 等. 腹腔連續(xù)注射低劑量氯胺酮后大鼠海馬LC3和Beclin1的表達(dá)[J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 27(2): 101-104.

ZHANG Y, CAO J J, LU J L, et al. Expression of LC3 and Beclin1 in rat hippocampus after repeated intraperitoneal administration of low dose of ketamine[J].ChineseJournalofForensicMedicine, 2012, 27(2): 101-104. (in Chinese)

[8] KASHIWAGI A, HOSOKAWA S, MAEYAMA Y, et al. Anesthesia with disuse leads to autophagy upregulation in the skeletal muscle[J].Anesthesiology, 2014, 122(5): 1075-1083.

[9] LI Z Q, LI L X, MO N, et al. Duration-dependent regulation of autophagy by isoflurane exposure in aged rats[J].NeurosciBull, 2015, 31(4): 505-513.

[10] 滕清宇, 李瑋偉, 袁紅斌, 等. 全麻藥發(fā)育期神經(jīng)毒性機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志, 2016, 32(9): 929-931.

TENG Q Y, LI W W, YUAN H B, et al. The research progress of neurotoxic mechanism in the development of total anesthetic[J].JournalofClinicalAnesthesiology, 2016, 32(9): 929-931. (in Chinese)

[11] 裴愛月. 海藻糖對(duì)異氟醚誘導(dǎo)轉(zhuǎn)APP基因小鼠海馬氧化應(yīng)激損傷的影響[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2016.

PEI A Y. Impact of trehalose on hippocampal oxidative stress injury induced by lsoflurane in APP Trangenic mice[D]. Changchun: Jilin University, 2016. (in Chinese)

[12] WANG Q, SHEN F Y, ZOU R, et al. Ketamine-induced apoptosis in the mouse cerebral cortex follows similar characteristic of physiological apoptosis and can be regulated by neuronal activity[J].MolBrain, 2017, 10: 24.

[13] 劇世強(qiáng), 郭慧利, 王利勤, 等. 豬體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育過程中的凋亡規(guī)律[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010, 41(6): 678-684.

JU S Q, GUO H L, WANG L Q, et al. Apoptotic law of porcine cloned embryos during developmentinvitro[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2010, 41(6): 678-684. (in Chinese)

[14] 楊 申. P38MAPK抑制劑對(duì)血管性癡呆大鼠海馬細(xì)胞凋亡、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)及其學(xué)習(xí)記憶能力的影響[D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué), 2013.

YANG S. The effect of P38MAPK inhibitor on hippocampus cells apoptosis BCL-2,Caspase-3 and learning memory ability in vascular dementia rat[D]. Jinan: Shandong University, 2013. (in Chinese)

[15] PENG J, DROBISH J K, LIANG G, et al. Anesthetic preconditioning inhibits isoflurane-mediated apoptosis in the developing rat brain[J].AnesthAnalg, 2014, 119(4): 939-946.

[16] 康 愷, 林 鷙, 高?；? 等. 豬瘟病毒促進(jìn)細(xì)胞自噬并利于病毒增殖[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 45(9): 1481-1487.

KANG K, LIN Z, GAO H H, et al. Classical swine fever virus promotes cell autophagy which facilitates virus proliferation[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2014, 45(9): 1481-1487. (in Chinese)

[17] XIONG J W, KONG Q Y, DAI L Y, et al. Autophagy activated by tuberin/mTOR/p70S6K suppression is a protective mechanism against local anaesthetics neurotoxicity[J].JCellMolMed, 2017, 21(3): 579-587.

[18] SHENG R, ZHANG T T, FELICE V D, et al. Preconditioning stimuli induce autophagy via sphingosine kinase 2 in mouse cortical neurons[J].JBiolChem, 2014, 289(30): 20845-20857.

[19] HUNG S Y, HUANG W P, LIOU H C, et al. Autophagy protects neuron from Aβ-induced cytotoxicity[J].Autophagy, 2009, 5(4): 502-510.

[20] TAKACS-VELLAI K, VELLAI T, PUOTI A, et al. Inactivation of the autophagy genebec-1 triggers apoptotic cell death inC.elegans[J].CurrBiol, 2005, 15(16): 1513-1517.

[21] 邵明玉. 自噬誘導(dǎo)劑海藻糖對(duì)鉛暴露幼鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2013.

SHAO M Y. Protective role of an autophagic inducer trehalvse on hippocampal neurons damaged by lead exposure in young rats[D]. Changchun: Jilin University, 2013. (in Chinese)

[22] 張彤彤. 鞘氨醇激酶-2在原代鼠皮層神經(jīng)元激活自噬介導(dǎo)缺血耐受[D]. 蘇州: 蘇州大學(xué), 2015.

ZHANG T T. Sphingosine kinase-2 induced autophagy activation mediates ischemic tolerance in primary cortical neurons[D]. Suzhou: Suzhou University, 2015. (in Chinese)