馬流產(chǎn)沙門菌鞭毛蛋白FliC對馬腺疫鏈球菌SeM蛋白免疫效應(yīng)分析

趙亞南，楊 康，張寶江，李 斌，蘇 艷

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

馬腺疫(Strangles)是由馬鏈球菌馬亞種(Streptococcusequisubsp.equi，S.equi)引起的馬屬動物表現(xiàn)發(fā)熱、上呼吸道卡他、下頜淋巴結(jié)和咽后淋巴結(jié)膿腫的傳染病[1-2]，該病仍危害著世界養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。滅活和弱毒馬腺疫疫苗的免疫效果均不理想[3-4]，不能有效防止該病的發(fā)生，且有較多的副反應(yīng)，SeM (Streptococcusequisubsp.equiM-like protein)為該菌重要的毒力因子和免疫原，該蛋白質(zhì)還可參與該菌的免疫逃避[5]，目前認(rèn)為以SeM蛋白為抗原制成的疫苗免疫馬匹效果不理想，產(chǎn)生的抗體持續(xù)時間較短，需進(jìn)行多次免疫[6]，國外使用的7種蛋白質(zhì)組分的亞單位疫苗雖然安全有效，但成本高，有必要研發(fā)更加安全、經(jīng)濟(jì)、有效的新型馬腺疫疫苗。研究表明，僅有抗體參與的免疫在其抗感染過程中是不夠的，還需要黏膜免疫及先天性免疫的參與。當(dāng)前被廣泛使用的鋁膠佐劑雖能引起強(qiáng)烈的體液反應(yīng)，但是卻不能觸發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答。

研究表明，鞭毛蛋白不僅具有較強(qiáng)的免疫原性[7-10]，還具有良好且獨(dú)特的免疫增強(qiáng)特性，不但可以啟動和促進(jìn)針對外源抗原的細(xì)胞免疫和黏膜免疫[11-12]，還可通過與多種細(xì)胞表面的TLR5結(jié)合上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)，有效誘導(dǎo)宿主獲得性免疫應(yīng)答[13]，該特點(diǎn)使得鞭毛蛋白在改善SeM的免疫效果方面具有良好的利用和開發(fā)潛力。

雖然有關(guān)鞭毛蛋白的免疫增強(qiáng)作用已在多種疫苗中得到了證實(shí)，如FMDV[14]、NDV[15]、AIV[16]、金黃色葡萄球菌[17]等，但報道的鞭毛蛋白多是有關(guān)鼠傷寒沙門菌的，有關(guān)馬流產(chǎn)沙門菌鞭毛蛋白的研究及其對馬腺疫SeM蛋白免疫效果的影響也未見報道。本研究表達(dá)純化了馬流產(chǎn)沙門菌的FliC蛋白，將純化的FliC蛋白與本室以往構(gòu)建表達(dá)的馬腺疫鏈球菌的SeM蛋白[18]聯(lián)合免疫小鼠，檢驗(yàn)該鞭毛蛋白FliC對SeM的免疫效果的影響，以期為新型馬腺疫疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

18～22 g雌性6～7周齡C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，馬鏈球菌馬亞種分離株XZ1由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。原核表達(dá)載體pGEX-4T-2及含重組質(zhì)粒pET28a-FliC和pGEX-SeM的大腸桿菌BL21(DE3)均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存提供。

中等分子量蛋白Marker購自大連寶生物工程有限公司；HRP-IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TMB及 DAB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；其他相關(guān)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化

將表達(dá)載體pGEX-4T-2和含重組質(zhì)粒pET-28a-FliC、pGEX-SeM的大腸桿菌BL21(DE3)[18-19]，在37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)到0.4，加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌體，經(jīng)超聲破碎后，用15% SDS-PAGE電泳，利用親和柱層析法對收集的上清液進(jìn)行純化。

1.3 重組蛋白質(zhì)的Western blot鑒定

將純化后的重組蛋白質(zhì)FliC經(jīng)SDS-PAGE電泳后，濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(300 mA，1 h)，于5%的脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜，以馬流產(chǎn)沙門菌陽性血清為一抗(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜后以HRP標(biāo)記的兔抗馬IgG(1∶5 000)為二抗，37 ℃孵育45 min，洗滌3次后，DAB顯色。重組蛋白 SeM 的Western blot 鑒定方法見文獻(xiàn)[18]。

1.4 小鼠免疫試驗(yàn)

將純化的重組蛋白SeM、FliC和GST標(biāo)簽蛋白按1∶1與弗氏佐劑乳化。SPF級18～22 g的雌性C57BL/6小鼠55只隨機(jī)分為5組，每組11只。分別設(shè)PBS對照組、GST對照組、重組蛋白FliC和SeM聯(lián)合免疫組、SeM免疫組、重組蛋白FliC免疫組，乳化后的抗原經(jīng)皮下多點(diǎn)注射小鼠，免疫劑量均為50 μg·只-1，2周后免疫第二次，共免疫2次。第一次免疫后14 d及第二次免疫后21 d對免疫小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，收集血清于-20 ℃保存。

采用間接ELISA法[20]測定重組蛋白質(zhì)免疫前、一免及二免后的抗體水平。用100 μL的重組蛋白FliC、SeM和FliC+SeM分別作包被抗原，100 ng·孔-14 ℃過夜包被，次日PBST洗滌5次后37 ℃封閉2 h，加入1∶300倍稀釋的待檢血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次后加入100 μL 1∶6 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作為二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗滌5次后，TMB溶液顯色15 min，測OD450nm值。將二免后的血清做3倍梯度稀釋，37 ℃封閉2 h后PBST洗5遍，加入100 μL梯度稀釋待檢血清為一抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次加入1∶6 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 100 μL作為二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗滌5次，加入TMB顯色15 min，測OD450nm值。

用100 μL重組蛋白FliC、SeM和FliC+SeM(100 ng·孔-1)分別4 ℃過夜包被ELISA板，封閉1 h，加入100 μL 1∶300的待檢血清，PBST洗滌5次后以1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a分別作為二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次后TMB顯色15 min，測OD450nm值。

挑取馬鏈球菌馬亞種XZ1株單菌落接種于TH培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，在二次免疫后30 d進(jìn)行攻毒，攻毒途徑均為腹腔注射，攻毒劑量為 4×108CFU·mL-1，攻毒后72 h內(nèi)連續(xù)觀察小鼠精神狀態(tài)及飲食欲并記錄小鼠死亡情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析one-way ANOVAq檢驗(yàn)進(jìn)行差異性比較，以P<0.05表示差異顯著，用不同小寫字母表示；以P<0.01表示差異極顯著，用不同大寫字母表示。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化

重組蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，SeM蛋白可在預(yù)期66 ku附近出現(xiàn)一條明顯的目的蛋白質(zhì)條帶(圖1a)，F(xiàn)liC蛋白可在預(yù)期的52 ku處出現(xiàn)一條明顯的目的蛋白質(zhì)條帶(圖1b)，GST標(biāo)簽蛋白可在預(yù)期的26 ku處出現(xiàn)一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，表明得到了較高純度的重組蛋白SeM和FliC和GST標(biāo)簽蛋白。

a. SeM的表達(dá)及純化；b. FliC的表達(dá)及純化；c. GST的表達(dá)及純化；M. 低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. 純化后重組蛋白質(zhì)；3.超聲上清；4. 誘導(dǎo)后SeM表達(dá)產(chǎn)物；5. 誘導(dǎo)前SeM表達(dá)產(chǎn)物；6.超聲上清；7.超聲沉淀；8、9. 純化后FliC重組蛋白；10. 空載體對照超聲上清；11. 空載體對照超聲沉淀；12、13. 純化后空載體對照的GST標(biāo)簽蛋白a.The expressed and purified protein SeM; b. The expressed and purified protein FliC; c. The expressed and purified protein GST; M. The low protein molecular weight marker; 1, 2. Purified recombinant SeM protein; 3. Supernatant after ultrasonic disruption; 4. Expressed SeM products; 5. SeM expression before induction; 6. Supernatant after ultrasonic disruption; 7. Pellets after ultrasonic disruption; 8, 9. Purified recombinant protein; 10. Supernatant after ultrasonic disruption of GST; 11. Pellets after ultrasonic disruption;12 and 13. Purified recombinant protein圖1 SDS-PAGE分析SeM、FliC、GST的表達(dá)Fig.1 SDS-PAGE analysis of the expression of the SeM, FliC, GST proteins

2.2 重組蛋白FliC的Western blot分析

Western blot結(jié)果鑒定，純化的重組蛋白FliC能與馬流產(chǎn)沙門菌陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，在52 ku處出現(xiàn)明顯特異性條帶，表明該重組蛋白表達(dá)成功且具有良好的反應(yīng)原性(圖2)。

2.3 免疫小鼠血清抗體的檢測

間接ELISA檢測結(jié)果顯示，各免疫組在免疫后抗體水平與對照組相比均有明顯升高，隨著免疫時

間推移，抗體水平持續(xù)上升(圖3)。分別以FliC+SeM、FliC及SeM作為包被抗原檢測時，F(xiàn)liC+SeM聯(lián)合免疫組在免疫后14和35 d的抗體水平均極顯著高于SeM單獨(dú)免疫組及對照組(圖3)。

分別以FliC+SeM、FliC及SeM為包被抗原對免疫小鼠血清中IgG亞型檢測，結(jié)果顯示以IgG1抗體為主的免疫應(yīng)答，且FliC+SeM聯(lián)合免疫組的IgG1抗體水平極顯著高于SeM單獨(dú)免疫組(圖4)。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 純化后重組蛋白FliCM. Protein molecular weight marker; 1. Purified recombinant protein FliC圖2 重組蛋白FliC的Western blot 分析Fig.2 Western blot analysis of recombinant protein FliC

2.4 小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)

第二次免疫后30 d以馬鏈球菌馬亞種新疆株XZ1進(jìn)行攻擊，PBS及GST對照組全部死亡，F(xiàn)liC+SeM免疫組的保護(hù)率為87%，SeM免疫組的保護(hù)率67%，F(xiàn)liC免疫組保護(hù)率為20%，該結(jié)果表明FliC與SeM聯(lián)合免疫時，免疫保護(hù)效果優(yōu)于SeM單獨(dú)免疫組及對照組(圖5)。

3 討 論

馬腺疫傳播迅速，在世界范圍內(nèi)發(fā)病比較普遍。隨著新疆馬產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，馬腺疫疾病的發(fā)病率和死亡率不斷升高。該病不僅嚴(yán)重影響了馬駒的正常發(fā)育，且已成為馬駒死亡的主要原因[21]。對該病的預(yù)防控制主要是使用疫苗，目前常規(guī)疫苗存在一定隱患，如毒力返強(qiáng)和滅活不徹底帶來的危害等。目前除了常規(guī)疫苗外，亞單位疫苗是被接受的一個有效的免疫預(yù)防手段。

a. FliC+SeM蛋白包被檢測血清抗體水平；b. FliC蛋白包被檢測血清抗體水平；c. SeM蛋白包被檢測血清抗體水平；同一時間內(nèi)上標(biāo)大寫字母不同表示組間差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)a. Detection of serum antibody levels that coated with FliC+SeM protein; b. Detection of serum antibody levels that coated with FliC protein antigen; c. Detection of serum antibody levels that coated with SeM protein antigen; In the same precedence, values with the difference capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01), values with the different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05)圖3 小鼠血清中特異性抗體水平的檢測Fig.3 Detection of serum specific antibody levels of mice

a. 用FliC+SeM做抗原檢測不同免疫組抗體亞型水平；b. 用FliC做抗原檢測不同免疫組抗體亞型水平水平；c. 用SeM做抗原檢測不同免疫組抗體亞型水平；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)a. The detection of Antibody subclass level between different immune groups by coating with FliC+SeM antigens; b. The detection of Antibody subclass level between different immune groups by coating with FliC antigens; c. The detection of Antibody subclass level between different immune groups by coating with SeM antigen; Difference capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01), difference lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05)圖4 免疫小鼠血清中特異性抗體亞型的水平檢測結(jié)果Fig.4 Antibody subtype level of mice serum

圖5 馬腺疫鏈球菌新疆株XZ1的攻擊存活率Fig.5 Survival rate against Streptococcus equi subspecies equi XZ1 challenge

SeM在馬腺疫鏈球菌的致病和免疫逃避中意義較大[5]，盡管其是該菌的保護(hù)性抗原，目前發(fā)現(xiàn)其純化蛋白誘導(dǎo)免疫保護(hù)的能力還有待改善。鞭毛蛋白作為一種蛋白佐劑有其獨(dú)特的優(yōu)勢，J. S. Eom等[22]通過構(gòu)建重組減毒鼠傷寒沙門菌，證明鞭毛蛋白可有效地刺激該菌產(chǎn)生特異性IgG抗體。包琦鋒等[23]將人乳頭瘤病毒(HPV)抗原基因插入到鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC的超變區(qū)域，對其進(jìn)行表達(dá)及純化。J. W. Huleatt等[24]以卵清蛋白(OVA)為抗原，鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC為佐劑將二者聯(lián)合免疫小鼠，證明鞭毛蛋白組誘導(dǎo)的IgG抗體滴度明顯高于鋁佐劑組。研究還表明鞭毛蛋白與不同抗原融合后也可發(fā)揮其佐劑作用，趙達(dá)[17]和王鶴[25]表達(dá)鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC與金黃色葡萄球菌及鏈球菌的GapC融合蛋白，免疫后的結(jié)果表明FliC增強(qiáng)了GapC蛋白的免疫效果。

在前期的研究中，我們已證實(shí)了SeM蛋白具有免疫原性和免疫保護(hù)效果[18]，本研究在此基礎(chǔ)上將表達(dá)的SeM蛋白與FliC蛋白以復(fù)合物的形式免疫，觀察鞭毛蛋白對SeM的免疫應(yīng)答的影響。二免后的抗體檢測結(jié)果表明，SeM抗原中加入馬流產(chǎn)沙門菌來源的FliC后注射小鼠，F(xiàn)liC+SeM所誘導(dǎo)的SeM特異性IgG水平高于SeM單獨(dú)免疫組和對照組，表明FliC可以增加血清中SeM 特異性IgG的水平，對SeM的免疫具有免疫增強(qiáng)反應(yīng)。

TLR5配體鞭毛蛋白作為天然免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑，不僅作用的細(xì)胞范圍廣，其誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答還可進(jìn)一步幫助機(jī)體建立針對外源抗原的獲得性免疫應(yīng)答。其通過活化抗原提呈細(xì)胞(APC)對抗原的加工、處理和提呈能力，可幫助小鼠產(chǎn)生顯著而全面的免疫應(yīng)答，進(jìn)而可以提供強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)。本試驗(yàn)中對小鼠攻擊保護(hù)試驗(yàn)的結(jié)果也表明，F(xiàn)liC+SeM免疫后對小鼠的保護(hù)率為87%，明顯高于SeM單獨(dú)免疫的67%。

有關(guān)鞭毛蛋白誘導(dǎo)何種類型的免疫，不同的研究顯示不同的結(jié)果。有研究表明，可溶性的鞭毛蛋白可誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞介導(dǎo)的抗體應(yīng)答，活的沙門菌表面的表面蛋白會誘導(dǎo)Th1型的細(xì)胞應(yīng)答[25]，其中IgG1亞型與Th2型的體液免疫應(yīng)答有關(guān)。本研究的結(jié)果顯示，F(xiàn)liC重組蛋白與SeM蛋白聯(lián)合免疫后可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG1抗體。該結(jié)果表明FliC+SeM誘導(dǎo)了Th2型的體液免疫應(yīng)答，F(xiàn)liC有增強(qiáng)SeM體液免疫效應(yīng)的作用。這與嚴(yán)明等[26]用鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白與肺炎鏈球菌DnaJ蛋白聯(lián)合免疫后抗體分型檢測得出抗體亞型以IgG1為主的結(jié)果是一致的。陳志華[14]將細(xì)菌的鞭毛蛋白與口蹄疫疫苗皮下聯(lián)合免疫小鼠，證明FliC對IgG1(Th2型)和IgG2a(Th1型)都有促進(jìn)作用，我們分析認(rèn)為這種免疫類型上的差異可能與所用的抗原類型和免疫途徑不同有關(guān)。

不同病原菌的鞭毛蛋白的佐劑效應(yīng)存在差異，鑒于文獻(xiàn)報道均是以鼠傷寒沙門菌來源的鞭毛蛋白入手研究鞭毛蛋白的免疫增強(qiáng)效應(yīng)，本研究原核表達(dá)了馬流產(chǎn)沙門菌來源的鞭毛蛋白FliC，并對表達(dá)蛋白對馬腺疫鏈球菌SeM蛋白免疫效果的影響作了初步探索。FliC能夠提高免疫小鼠血清中SeM特異性IgG及IgG1的水平，下一步將進(jìn)一步探討該蛋白質(zhì)通過不同免疫途徑和免疫策略免疫馬匹后對馬腺疫強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)力，以期為馬腺疫的免疫預(yù)防提供新的思路與方法。

4 結(jié) 論

成功表達(dá)、純化了馬流產(chǎn)沙門菌來源的FliC重組蛋白。以該重組蛋白質(zhì)與馬腺疫鏈球菌SeM蛋白聯(lián)合免疫C57BL/6小鼠產(chǎn)生的抗體水平高于SeM蛋白單獨(dú)免疫組，且主要以IgG1抗體為主。第二次免疫30 d后攻毒，F(xiàn)liC+SeM免疫組的保護(hù)率為87%，高于SeM免疫組的保護(hù)率67%。FliC蛋白能夠增強(qiáng)SeM蛋白的免疫保護(hù)效果。

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