gga-miR-140-3p抑制馬立克病病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞MSB1增殖、遷移和侵襲

趙春芳，李 新，韓 博，曲魯江, 劉長軍, Jiuzhou Song, 連 玲*，楊 寧*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京100193; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室，哈爾濱150001；3. 馬里蘭大學(xué)帕克分校動物與禽類科學(xué)系, 馬里蘭州 20742, 美國)

馬立克病 (Marek’s disease, MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus, MDV)引起的惡性T淋巴細(xì)胞增生性腫瘤疾病；它是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)和家禽健康的傳染病[1]。MDV屬于馬立克病毒屬，又稱為禽皰疹病毒2型。體內(nèi)感染MDV可以分為四個階段，分別為病毒溶細(xì)胞感染(感染病毒后的3至6 d)，潛伏感染(感染病毒后的7至10 d)，溶細(xì)胞感染第二階段(感染病毒后的10至14 d)和腫瘤轉(zhuǎn)化(感染病毒后的21 d)[2-3]。越來越多的微小RNA (microRNA, miRNA)在病毒引起的腫瘤性疾病中扮演重要角色，其中包括miRNA-181a[4]、miRNA-26a[5-6]、miRNA-219[7]等。

miRNA是小的單鏈非編碼RNA，長度約22個核苷酸，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育和腫瘤發(fā)生等生物過程中扮演重要角色[8]。miRNA通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄或者mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮作用[9]?，F(xiàn)在，越來越多與MD腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的宿主miRNA和病毒miRNA被挖掘出來。gga-miR-155只在MDV轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，這可以作為MD腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)的標(biāo)志[10]。MDV編碼的Mdv1-miR-M4-5p和gga-miR-155具有高度同源性，對MDV的原癌性具有至關(guān)重要的作用[11]；并且它能通過靶向潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白1(Latent TGF-β binding protein 1, LTBP1)激活原癌基因c-Myc，從而抑制TGF-β信號通路[12]。Z.J.Li等[13]發(fā)現(xiàn)了79個感染MDV后表達(dá)呈顯著差異的miRNA，并發(fā)現(xiàn)兩類可以作為MDV感染和MD腫瘤發(fā)生指示標(biāo)志的miRNA。gga-miR-26a在MDV引發(fā)的腫瘤中低表達(dá)[14]，在禽類轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞系中介導(dǎo)白細(xì)胞介素2[5](interleukin-2, IL-2)和NIMA相關(guān)激酶6[6](NIMA related kinase 6, NEK6)的表達(dá)，并能抑制MD淋巴瘤細(xì)胞增殖。gga-miR-181a通過抑制類v-myb成髓細(xì)胞瘤病毒原癌基因同源體1(v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog-like 1, MYBL1)使MSB1細(xì)胞增殖發(fā)生抑制[15]。

我們利用Solexa深度測序分析了MD腫瘤組和非感染組的miRNA表達(dá)譜[16]，發(fā)現(xiàn)gga-miR-140-3p在MDV引發(fā)的腫瘤組織中表達(dá)異常。本研究檢測該miRNA對MD腫瘤細(xì)胞MSB1增殖、遷移的影響以及對與侵襲密切相關(guān)的MMP2、MMP9基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

試驗(yàn)雞群和馬立克病毒毒株(MDV-GA)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。試驗(yàn)選擇150只 無特定病原體(specific pathogen free, SPF)的白來航雞，分成2組，攻毒組100只，對照組50只。在1日齡時攻毒組個體腹腔注射MDV-GA(2 000 PFU)國際標(biāo)準(zhǔn)毒株0.2 mL。對照組注射同等劑量的無病毒稀釋液。兩組雞分開飼養(yǎng)在不同的負(fù)壓隔離器中，其他試驗(yàn)條件一致，試驗(yàn)全期56 d。MDV感染后30 d，剩余66只MDV感染雞和28只未感染對照組雞。在感染MDV的第30～56天，一共有47只雞形成腫瘤，另外19只雞狀態(tài)良好，未形成腫瘤。在感染后31～55 d，連續(xù)觀察雞群狀態(tài)，對外觀表現(xiàn)為嚴(yán)重病癥的個體進(jìn)行屠宰，同時屠宰未感染對照組個體。個體屠宰后收集脾、肝和各組織來源的MD 淋巴瘤。所有組織保存在RNA保存液中用于RNA的提取。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和miRNA轉(zhuǎn)染

MDV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞系，MDCC-MSB1，由C. Itakura博士友情饋贈，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置于溫度37 ℃，相對濕度95%,含有5% CO2的培養(yǎng)箱中。FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑(Promega公司)用于miRNA轉(zhuǎn)染，用于轉(zhuǎn)染的miRNA激動劑(agomir)和陰性對照(Negative control, NC)劑量分別為100 nmol·L-1。gga-miR-140-3p agomir和NC購自上海吉瑪公司。

1.3 RNA提取和實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)

利用Trizol試劑(Invitrogen公司)按照說明書要求提取冰凍組織或細(xì)胞總RNA。利用cDNA synthesis kit (miRACLE公司)反轉(zhuǎn)錄miRNA; qPCR miRNA kit(miRACLE公司)用于miRNA定量檢測, 每組8個樣本。用于檢測內(nèi)對照5S的上游引物序列為5′-ACCGGGTGCTGTAGGCTTAA-3′;檢測gga-miR-140-3p的上游引物序列為5′-AGGGTAGAACCACGGACAAAA-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，qRT-PCR反應(yīng)在Invitrogen公司的ABI 7500儀器上進(jìn)行40個循環(huán)。

利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen公司)將總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA用于基因表達(dá)水平的檢測。使用Power SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogen公司)在ABI 7500儀器上進(jìn)行qRT-PCR，每組三個生物學(xué)重復(fù)。引物信息如下：β-actin上游引物為5′-GAGAAATTGTGCGTGACATCA-3′，下游引物為5′-CCTGAACCTCTCATTGCCA-3′；MMP2上游引物為5′-TGAAACAGGAGATTTGGAT-3′，下游引物為5′-CATTTTGGCTTTCTTGGA-3′,MMP9上游引物為5′-ACCTGGACCGTGCCGTGAT-3′,下游引物為5′-TGCCTCGCCGCTGTAAAT-3′。基因的相對表達(dá)量以5S和β-actin為參考基因通過2-ΔΔCt方法表達(dá)為倍數(shù)變化。

1.4 細(xì)胞增殖檢測

在96孔板中接種95 μL細(xì)胞懸液(3×104·孔-1)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后的24、36、48、60和72 h利用CCK-8檢測細(xì)胞增殖。檢測時每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用分光光度計(jì)在450 nm測定吸光度。每組設(shè)置5個重復(fù)。

1.5 細(xì)胞遷移檢測

所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和Transwell chamber (8 mm孔徑; BD Bioscience公司)放在37 ℃溫育。在24孔板中接種500 μL細(xì)胞懸液(1.5×105·孔-1)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)。在Transwell下室加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，每孔5×104個細(xì)胞，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，收集下室的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每組設(shè)置2個重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 gga-miR-140-3p在不同組織中的差異表達(dá)

gga-miR-140-3p在不同組織中的表達(dá)量見圖1。與非感染組脾相比，gga-miR-140-3p在腫瘤化脾中顯著下調(diào)(P<0.05)；與非感染組肝相比，gga-miR-140-3p在肝淋巴瘤中也呈現(xiàn)顯著低表達(dá)(P<0.05)(圖1)。結(jié)果表明該miRNA在MD腫瘤化組織中表達(dá)下調(diào)。

NS. 非感染脾；TS. 腫瘤化脾；NL. 非感染肝；LL. 肝淋巴瘤。n=8, *.P<0.05NS. Non-infected spleen; TS. Tumorous spleen; NL. Non-infected liver; LL. MD lymphoma from liver. n=8. *.P<0.05圖1 不同組織中g(shù)ga-miR-140-3p表達(dá)水平Fig.1 Differential expression of gga-miR-140-3p in different tissues

2.2 gga-miR-140-3p對MD腫瘤細(xì)胞MSB1增殖的影響

過表達(dá)gga-miR-140-3p對MSB1細(xì)胞增殖影響的檢測結(jié)果見圖2。與對照組相比，轉(zhuǎn)染gga-miR-140-3p agomir后的24、36、48 h細(xì)胞吸光值顯著(P<0.05)降低，60和72 h吸光值極顯著(P<0.01)降低(圖2)。這表明該miRNA能顯著抑制MD腫瘤淋巴細(xì)胞增殖。

n=5，*.P<0.05，**.P<0.01圖2 gga-miR-140-3p對MSB1細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of gga-miR-140-3p on MSB1 cell proliferation

2.3 gga-miR-140-3p對MD腫瘤細(xì)胞MSB1遷移的影響

過表達(dá)gga-miR-140-3p對MSB1細(xì)胞遷移影響的檢測結(jié)果見圖3。與對照組相比，轉(zhuǎn)染gga-miR-140-3p agomir后，Transwell下室中的細(xì)胞數(shù)目顯著(P<0.05)較低(圖3)。這表明該miRNA能顯著抑制MSB1細(xì)胞遷移。

2.4 gga-miR-140-3p對MD腫瘤細(xì)胞MSB1侵襲的影響

過表達(dá)gga-miR-140-3p對MMP2、MMP9轉(zhuǎn)錄量影響的檢測結(jié)果見圖4。轉(zhuǎn)染gga-miR-140-3pagomir后，MMP2轉(zhuǎn)錄量在24 h顯著(P<0.05)降低，48和72 h極顯著(P<0.01)降低(圖4a)；MMP9轉(zhuǎn)錄量在48 h顯著(P<0.05)降低(圖4b)。這表明該miRNA能夠影響與侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而可能影響MD腫瘤細(xì)胞侵襲。

n=2，*.P<0.05圖3 gga-miR-140-3p對MSB1細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effect of gga-miR-140-3p on MSB1 cell migration

n=3，*.P<0.05，**.P<0.01圖4 gga-miR-140-3p對MMP2和MMP9轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 Effect of gga-miR-140-3p on MMP2 and MMP9 mRNA expression level

3 討 論

作為一種短的非編碼RNA，miRNA參與腫瘤發(fā)生的報(bào)道日趨增多[17-21]。在前期試驗(yàn)中，通過Solexa高通量測序發(fā)現(xiàn)gga-miR-140-3p在MDV引發(fā)的腫瘤化脾及肝淋巴瘤中表達(dá)異常[16]，提示該miRNA或許能夠作為MD腫瘤發(fā)生的生物標(biāo)記。MDCC-MSB1細(xì)胞是一種由感染MDV BC-1毒株引發(fā)的脾淋巴瘤制備的細(xì)胞系，主要由CD4+T細(xì)胞組成，可以作為研究MD腫瘤轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型[22-23]。為揭示gga-miR-140-3p在MD腫瘤轉(zhuǎn)化過程中的作用，我們研究了它對腫瘤細(xì)胞MSB1功能的影響，結(jié)果表明該miRNA在一定程度上能夠影響MD腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，同時能影響與侵襲密切相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

miR-140在多種癌癥中表達(dá)紊亂，通過靶向不同靶基因發(fā)揮各種各樣的作用。miR-140-3p在肺鱗狀細(xì)胞癌[24]、卵巢癌[25]、鱗狀上皮細(xì)胞癌[26]和基質(zhì)細(xì)胞瘤[27]中表達(dá)下調(diào)，扮演腫瘤抑制因子的作用；然而在脊髓脊索瘤[28]中表達(dá)上調(diào)，扮演原癌miRNA的角色。F. Tian等[29]報(bào)道，與非感染組相比，感染MDV后gga-miR-140在MD易感系72脾中表達(dá)下調(diào)。L. Lian等[30]報(bào)道在感染MDV 14 d后，gga-miR-140-3p在感染脾中的表達(dá)量顯著降低，表明該miRNA表達(dá)異常在腫瘤轉(zhuǎn)化前期就已發(fā)生，腫瘤細(xì)胞在早期已經(jīng)開始滲透入脾。我們的研究結(jié)果也顯示gga-miR-140-3p在MDV引發(fā)的腫瘤化脾中表達(dá)下調(diào)。在感染MDV的雞肌肉成纖維細(xì)胞(chicken embryo fibroblast, CEF)中，gga-miR-140-3p呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢[31]；然而，我們發(fā)現(xiàn)gga-miR-140-3p在感染MDV的腫瘤化脾和肝淋巴瘤中表達(dá)比非感染組低。造成該miRNA表達(dá)差異的原因可能是因?yàn)镃EF和脾、肝的細(xì)胞組成成分不一致，CEF主要是肌肉成纖維細(xì)胞，而脾和肝中含有大量的淋巴細(xì)胞。在骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中，過表達(dá)miR-140能夠誘導(dǎo)p53和p21表達(dá)，同時伴隨細(xì)胞周期G1和G2期阻滯；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該miRNA是通過靶向組蛋白去乙酰酶4(histone deacetylase 4, HDAC4)介導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程[32]。在骨肉瘤細(xì)胞MG63中，過表達(dá)miR-140使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時細(xì)胞遷移發(fā)生抑制[33]。過表達(dá)gga-miR-140-3p顯著抑制MSB1細(xì)胞增殖，提示該miRNA可能參與MD腫瘤細(xì)胞增殖。不過增殖發(fā)生抑制的原因是由細(xì)胞周期阻滯還是凋亡抑制引發(fā)還需要進(jìn)一步研究。過表達(dá)miR-140-3p抑制肺癌細(xì)胞A549和H1299的增殖、遷移和侵襲[34]。在非小細(xì)胞肺癌裸鼠中，miR-140-3p靶向ATP酶磷脂運(yùn)輸8A1(ATPase phospholipid transporting 8A1, ATP8A1)誘導(dǎo)凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并且該miRNA抑制細(xì)胞遷移和侵襲[35]。遷移作為腫瘤轉(zhuǎn)化的重要特征之一，我們利用Transwell進(jìn)行遷移試驗(yàn)檢測過表達(dá)gga-miR-140-3p對MSB1遷移能力的影響?？紤]到MSB1屬于懸浮細(xì)胞，細(xì)胞無法黏附在Transwell上室的膜上，而是會移動到下室的培養(yǎng)基中，所以我們采用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法來反映細(xì)胞遷移情況，過表達(dá)gga-miR-140-3p顯著抑制MSB1細(xì)胞遷移。金屬基質(zhì)蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)能夠降解基底膜的主要組成成分——Ⅳ型膠原蛋白，參與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，其中MMP2和MMP9是MMP家族的重要成員[36-39]。定量檢測MMP2和MMP9基因表達(dá)可以間接反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。過表達(dá)gga-miR-140-3p抑制MMP2和MMP9的表達(dá)，提示該miRNA可能通過抑制細(xì)胞侵襲影響MD腫瘤轉(zhuǎn)化過程。

4 結(jié) 論

gga-miR-140-3p作為在MD腫瘤中異常表達(dá)的miRNA，能夠影響MD腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示該miRNA可能通過影響腫瘤細(xì)胞功能參與腫瘤轉(zhuǎn)化過程，該miRNA可以作為MD腫瘤發(fā)生的指示標(biāo)志。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] BIGGS P M. The Leeuwenhoek Lecture,1997. Marek’s disease herpesvirus:oncogenesis and prevention[J].PhilosTransRSocLondBBiolSci, 1997, 352(1364):1951-1962.

[2] CALNEK B W. Marek’s disease-a model for herpesvirus oncology[J].CritRevMicrobiol, 1986, 12(4):293-320.

[3] CALNEK B W. Pathogenesis of Marek’s disease virus infection[J].CurrTopMicrobiolImmunol, 2001, 255:25-55.

[4] BHATTACHARYA S D, GARRISON J, GUO H T, et al. Micro-RNA-181a regulates osteopontin-dependent metastatic function in hepatocellular cancer cell lines[J].Surgery, 2010, 148(2):291-297.

[5] XU H T, YAO Y X,SMITH L P,et al.MicroRNA-26a-mediated regulation of interleukin-2 expression in transformed avian lymphocyte lines[J].CancerCellInt, 2010, 10:15.

[6] LI X, LIAN L, ZHANG D X, et al.gga-miR-26a targets NEK6 and suppresses Marek’s disease lymphoma cell proliferation[J].PoultSci, 2014, 93(5):1097-1105.

[7] FAVREAU A J, SATHYANARAYANA P. miR-590-5p,miR-219-5p,miR-15b and miR-628-5p are commonly regulated by IL-3,GM-CSF and G-CSF in acute myeloid leukemia[J].LeukRes, 2012, 36(3):334-341.

[8] BARTEL D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[9] BRENNECKE J, STARK A, RUSSELL R B, et al. Principles of microRNA-target recognition[J].PLoSBiol, 2005, 3(3):e85.

[10] YAO Y X, ZHAO Y G,SMITH L P, et al. Differential expression of microRNAs in Marek’s disease virus-transformed T-lymphoma cell lines[J].JGenVirol, 2009, 90(Pt 7):1551-1559.

[11] ZHAO Y G,YAO Y X,XU H T,et al.A functional MicroRNA-155 ortholog encoded by the oncogenic Marek’s disease virus[J].JVirol, 2009, 83(1):489-492.

[12] CHI J Q, TENG M,YU Z H, et al. Marek′s disease virus-encoded analog of microRNA-155 activates the oncogene c-Myc by targeting LTBP1 and suppressing the TGF-β signaling pathway[J].Virology, 2015, 476:72-84.

[13] LI Z J,ZHANG Y P,LI Y,et al.Distinct expression pattern of miRNAs in Marek’s disease virus infected-chicken splenic tumors and non-tumorous spleen tissues[J].ResVetSci, 2014, 97(1):156-161.

[14] BURNSIDE J,OUYANG M,ANDERSON A, et al. Deep sequencing of chicken microRNAs[J].BMCGenomics, 2008, 9:185.

[15] LIAN L,LI X,ZHAO C F, et al. Chicken gga-miR-181a targets MYBL1 and shows an inhibitory effect on proliferation of Marek’s disease virus-transformed lymphoid cell line[J].PoultSci, 2015, 94(11):2616-2621.

[16] LIAN L, QU L J, CHEN Y M, et al. A systematic analysis of miRNA transcriptome in Marek’s disease virus-induced lymphoma reveals novel and differentially expressed miRNAs[J].PLoSOne, 2012, 7(11):e51003.

[17] LI X,LIAN L,ZHANG D X, et al.gga-miR-26a targets NEK6 and suppresses Marek’s disease lymphoma cell proliferation[J].PoultSci, 2014, 93(5):1097-1105.

[18] LIAN L,LI X,ZHAO C F,et al.Chicken gga-miR-181a targets MYBL1 and shows an inhibitory effect on proliferation of Marek’s disease virus-transformed lymphoid cell line[J].PoultSci, 2015, 94(11):2616-2621.

[19] HAN B, LIAN L, LI X, et al.Chicken gga-miR-130a targets HOXA3 and MDFIC and inhibits Marek’s disease lymphoma cell proliferation and migration[J].MolBiolRep, 2016, 43(7):667-676.

[20] ZHAO C F, LI X, HAN B, et al.Gga-miR-219b targeting BCL11B suppresses proliferation,migration and invasion of Marek’s disease tumor cell MSB1[J].SciRep, 2017, 7:4247.

[21] TIAN F, LUO J, ZHANG H M, et al. MiRNA expression signatures induced by Marek’s disease virus infection in chickens[J].Genomics, 2012, 99(3):152-159.

[22] AKIYAMA Y, KATO S. Two cell lines from lymphomas of Marek’s disease[J].BikenJ, 1974, 17(3):105-116.

[23] NAZERIAN K. An updated list of avian cell lines and transplantable tumours[J].AvianPathol, 1987, 16(3):527-544.

[24] TAN X G, QIN W Y, ZHANG L, et al. A 5-microRNA signature for lung squamous cell carcinoma diagnosis and hsa-miR-31 for prognosis[J].ClinCancerRes, 2011, 17(21):6802-6811.

[25] MILES G D, SEILER M, RODRIGUEZ L, et al. Identifying microRNA/mRNA dysregulations in ovarian cancer[J].BMCResNotes, 2012, 5:164.

[26] SAND M,SKRYGAN M,GEORGAS D, et al. Microarray analysis of microRNA expression in cutaneous squamous cell carcinoma[J].JDermatolSci, 2012, 68(3):119-126.

[27] SAND M,SKRYGAN M, SAND D, et al. Expression of microRNAs in basal cell carcinoma[J].BrJDermatol, 2012, 167(4):847-855.

[28] ZOU M X,HUANG W,WANG X B, et al. Identification of miR-140-3p as a marker associated with poor prognosis in spinal chordoma[J].IntJClinExpPathol, 2014, 7(8):4877-4885.

[29] TIAN F, LUO J, ZHANG H M, et al. MiRNA expression signatures induced by Marek’s disease virus infection in chickens[J].Genomics, 2012, 99(3):152-159.

[30] LIAN L, ZHANG D X, WANG Q, et al. The inhibitory effects of gga-miR-199-3p,gga-miR-140-3p,and gga-miR-221-5p in Marek’s disease tumorigenesis[J].PoultSci, 2015, 94(9):2131-2135.

[31] BURNSIDE J, OUYANG M, ANDERSON A, et al. Deep sequencing of chicken microRNAs[J].BMCGenomics, 2008, 9:185.

[32] SONG B, WANG Y, XI Y, et al. Mechanism of chemoresistance mediated by miR-140 in human osteosarcoma and colon cancer cells[J].Oncogene, 2009, 28(46):4065-4074.

[33] GU R,SUN Y F, WU M F, et al. Biological roles of microRNA-140 in tumor growth, migration, and metastasis of osteosarcomainvivoandinvitro[J].TumourBiol, 2016, 37(1):353-360.

[34] KONG X M, ZHANG G H, HUO Y K, et al. MicroRNA-140-3p inhibits proliferation, migration and invasion of lung cancer cells by targeting ATP6AP2[J].IntJClinExpPathol, 2015, 8(10):12845-12852.

[35] DONG W, YAO C P, TENG X P, et al. MiR-140-3p suppressed cell growth and invasion by downregulating the expression of ATP8A1 in non-small cell lung cancer[J].TumourBiol, 2016, 37(3):2973-2985.

[36] STETLER-STEVENSON W G, AZNAVOORIAN S,LIOTTA L A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis[J].AnnuRevCellBiol, 1993, 9(1):541-573.

[37] SUN J, HEMLER M E. Regulation of MMP-1 and MMP-2 production through CD147/extracellular matrix metalloproteinase inducer interactions[J].CancerRes, 2001, 61(5):2276-2281.

[38] LUO Y,LIANG F B,ZHANG Z Y.PRL1 promotes cell migration and invasion by increasing MMP2 and MMP9 expression through Src and ERK1/2 pathways[J].Biochemistry, 2009, 48(8):1838-1846.

[39] TABOURET E,BOUDOURESQUE F,FARINA P,et al.MMP2 and MMP9 as candidate biomarkers to monitor bevacizumab therapy in high-grade glioma[J].NeuroOncol, 2015, 17(8):1174-1176.