二重?zé)晒釸T-LAMP方法鑒別檢測(cè)口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒

范 晴，謝芝勛，謝志勤，謝麗基，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷，王 盛，羅思思，鄧顯文，劉加波

(廣西獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

口蹄疫(foot-and-mouth disease virus, FMDV)和水泡性口炎(vesicular stomatitis virus, VSV)是兩種牛常見(jiàn)高度急性病毒傳染病，一般呈暴發(fā)性流行，一旦暴發(fā)會(huì)給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定上報(bào)動(dòng)物疫病[1-2]。FMDV和VSV引起的臨床病狀非常相似，難以區(qū)分，均表現(xiàn)為流涎，發(fā)燒，跛行，口腔、乳頭和蹄部冠狀帶等處發(fā)生水泡及潰瘍[3-5]。因此急需建立口蹄疫和水泡性口炎的快速鑒別檢測(cè)技術(shù)，為我國(guó)FMDV和VSV的防控提供技術(shù)支持。

目前FMDV分為7個(gè)血清型：A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaⅠ型，每個(gè)型又可以進(jìn)一步分為不同的亞型。我國(guó)流行的是A、O和AsiaⅠ型。VSV分為新澤西型(NJ型)和印第安型(IND型)，在引起家畜發(fā)病的血清型中，NJ型占多數(shù)。在我國(guó)，VSV通常呈點(diǎn)狀散發(fā)，一般不廣泛流行[6]。

目前OIE推薦的檢測(cè)FMDV和VSV的分子生物學(xué)方法主要是RT-PCR和熒光RT-PCR方法[7-8]。但RT-PCR和熒光RT-PCR都有一些自身的局限性，如RT-PCR敏感性較低，熒光RT-PCR成本較高，需要昂貴的儀器設(shè)備等。環(huán)介導(dǎo)的體外等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在PCR方法上發(fā)展起來(lái)的新興核酸檢測(cè)技術(shù)，突破了恒溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)難點(diǎn)，6條引物同時(shí)擴(kuò)增，敏感性高，特異性好，已在多種疾病的檢測(cè)上得到應(yīng)用[9-13]。目前國(guó)內(nèi)雖然已有多位學(xué)者建立了多重LAMP檢測(cè)方法，但這些方法都有一定的局限性，不能確定具體到底是哪一種病原所引起的陽(yáng)性結(jié)果，不是真正意義上的鑒別診斷。本研究首次在LAMP方法中引入了熒光基團(tuán)，擬建立檢測(cè)FMDV和VSV的二重?zé)晒釸T-LAMP方法，通過(guò)顏色觀察同時(shí)鑒別檢測(cè)FMDV和VSV。

1 材料與方法

1.1 毒株與菌株

口蹄疫滅活疫苗A型、O型、AsiaⅠ型購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，口蹄疫滅活病毒O型、A型、AsiaⅠ型，水泡性口炎滅活病毒新澤西型(NJ型)和印第安型(IND型)，藍(lán)舌病滅活病毒(4型、8型、9型、15型、17型、18型)，小反芻獸疫(PPRV)滅活病毒由云南出入境檢驗(yàn)檢疫局惠贈(zèng)。4株牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)參考毒株，2株牛輪狀病毒(BRV)參考毒株，1株牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)參考毒株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，3株產(chǎn)腸毒大腸桿菌(ETEC)，3株牛支原體(MB)廣西分離株由廣西獸醫(yī)研究所分離保存。

1.2 主要試劑及儀器

LAMP RNA擴(kuò)增試劑盒，Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀購(gòu)自日本榮研公司；RNA，DNA抽提試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒，pGM-T載體購(gòu)自北京天根公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；NanoDrop 2000核酸測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；多色熒光成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 DNA/RNA的提取

按全式金RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)，抽提FMDV、VSV、BTV、BVDV、BRV、PPRV的RNA，-70 ℃保存；用DNA抽提試劑盒抽提ETEC、MB、IBRV的DNA，-20 ℃保存，備用。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中FMDV(O型、A型、Asia Ⅰ型)3D基因和VSV(NJ型和IND型)N基因的保守序列，利用DNAStar MegAlign和PrimerexploreV4軟件，設(shè)計(jì)2套LAMP引物。每套引物各針對(duì)6個(gè)位點(diǎn)，包括4條引物：外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2)，在每條內(nèi)引物的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)：FMDV FIP引物標(biāo)記FITC，在520 nm波長(zhǎng)下呈黃綠色，VSV FIP引物標(biāo)記CY5.5，在694 nm波長(zhǎng)下呈大紅色。所有引物由大連寶生物公司合成，引物示意圖見(jiàn)圖1，引物序列見(jiàn)表1。

圖1 二重?zé)晒釸T-LAMP引物設(shè)計(jì)示意圖Fig.1 Schematic diagrams of duplex RT-LAMP primers

表1 二重?zé)晒釸T-LAMP引物序列Table 1 The primer sequences of duplex RT-LAMP

1.5 反應(yīng)體系

25 μL反應(yīng)體系：1 μL RNA模板，2.5 μL 10×buffer [成分為200 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，100 mmol·L-1KCl，80 mmol·L-1MgSO4，100 mmol·L-1(NH4)2SO4，1%Tween20，8 mol·L-1betaine和14 mmol·L-1dNTPs]，酶溶液1 μL(含15 U Bst DNA聚合酶，10 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)，內(nèi)引物各40 pmol·L-1(FMDV-FIP、FMDV-BIP、VSV-FIP和VSV-BIP)，外引物各5 pmol·L-1(FMDV-F3、FMDV-B3、VSV-B3和VSV-F3)。各組分混合均勻，置恒溫儀或水浴鍋62 ℃反應(yīng)105 min，最后80 ℃作用5 min終止反應(yīng)。

1.6 二重?zé)晒釸T-LAMP結(jié)果判定

二重?zé)晒釸T-LAMP與普通LAMP方法一樣，可通過(guò)肉眼觀察白色沉淀，加染料觀察顏色變化，實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)濁度的方法判斷擴(kuò)增結(jié)果。此外，可使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(100 V,40 min)，內(nèi)引物FIP上標(biāo)記有熒光基團(tuán)，可在特定的熒光通道下顯示不同顏色。FMDV陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物在520 nm通道下顯示黃綠色，VSV在670 nm通道下顯示大紅色，且兩熒光通道相互獨(dú)立無(wú)干擾，即在520 nm通道下不能觀察到VSV的擴(kuò)增條帶，在670 nm通道下不能觀察到FMDV的擴(kuò)增條帶，結(jié)果獨(dú)立、準(zhǔn)確。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)品制備

分別用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增FMDV外引物(FMDV-B3、FMDV-F3)片段186 bp和VSV外引物(VSV-F3、VSV-B3)片段199 bp，用瓊脂糖凝膠回收純化，連入pGM-T載體，篩選陽(yáng)性重組菌，用質(zhì)粒試劑盒提取陽(yáng)性重組菌的質(zhì)粒。參照T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將DNAs酶切線性化，用DNA酶消除其中DNA的污染，體外轉(zhuǎn)錄為RNA，用OD260 nm測(cè)定RNA濃度，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)換為拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies·μL-1)=質(zhì)粒濃度(g·μL-1)×10-9×6.02×1023/660×3 000, 將兩種體外轉(zhuǎn)錄RNA等量混合，梯度稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 特異性試驗(yàn)

按照所建立的口蹄疫和水泡性口炎二重?zé)晒釸T-LAMP方法，檢測(cè)FMDV(A、O和Asia Ⅰ型)、VSV(NJ型、IND型)、藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒的RNA，以及產(chǎn)腸毒大腸桿菌、牛支原體、牛傳染性鼻氣管炎的DNA，驗(yàn)證二重?zé)晒釸T-LAMP方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn)

將“1.7”制備的FMDV和VSV體外反轉(zhuǎn)錄RNA模板等濃度混合并以10倍梯度系列稀釋，保證每種模板濃度為1×108～1拷貝·μL-1，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，用二重?zé)晒釸T-LAMP檢測(cè)，重復(fù)3次。

1.10 干擾性試驗(yàn)

將FMDV和VSV標(biāo)準(zhǔn)樣品按不同濃度進(jìn)行組合，制備不同濃度模擬混合感染樣品：樣品1 FMDV(106拷貝·μL-1)+ VSV(102拷貝·μL-1)，樣品2 FMDV(107拷貝·μL-1)+ VSV(104拷貝·μL-1)，樣品3 FMDV(102拷貝·μL-1)+ VSV(106拷貝·μL-1)，樣品4 FMDV (104拷貝·μL-1)+VSV(107拷貝·μL-1)。用二重?zé)晒釸T-LAMP檢測(cè)，確定高濃度模板是否會(huì)抑制低濃度模板的擴(kuò)增效率。

1.11 臨床樣品檢測(cè)

10份可疑牛樣品(水泡皮和水泡液拭子)采集自廣西某地區(qū)，均來(lái)自口腔出現(xiàn)水泡樣潰爛的牛。用二重?zé)晒釸T-LAMP對(duì)10份可疑牛樣品進(jìn)行檢測(cè)，并將結(jié)果與OIE推薦的方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證本方法的可靠性[7-8]。

2 結(jié) 果

2.1 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法只擴(kuò)增FMDV和VSV核酸，以及FMDV和VSV混合模板(圖2)。FMDV陽(yáng)性呈黃綠色，僅在520 nm通道下能看到；VSV陽(yáng)性呈大紅色，僅在670 nm通道下能看到；FMDV和VSV混合模板呈紅綠混合色，且在520 nm和670 nm通道下都能觀察到。而對(duì)其他牛病毒和陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增，部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，全部特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)該方法特異性好。

1. FMDV A型；2. FMDV O型；3. FMDV Asia Ⅰ型；4. VSV NJ 型；5. VSV IND型；6. FMDV A型和VSV NJ型；7～13. BTV 4型、PPRV、BVDV、BRV、IBRV、MB、ETEC；14.陰性對(duì)照1. FMDV A; 2. FMDV O; 3. FMDV Asia Ⅰ; 4. VSV NJ; 5. VSV IND; 6. FMDV A and VSV NJ; 7-13. BTV 4, PPRV, BVDV, BRV, IBRV, MB, ETEC, respectively; 14. Negative control圖2 二重?zé)晒釸T-LAMP特異性試驗(yàn)電泳結(jié)果Fig.2 Agarose-gel electrophoresis of specificity results of the duplex RT-LAMP for FMDV and VSV

表2 二重?zé)晒釸T-LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Specificity results of the duplex RT-LAMP for FMDV and VSV

(續(xù)表2 Continued)

GVRI.廣西獸醫(yī)研究所；YNCIQ.云南出入境檢疫檢疫局；CVCC.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
GVRI. Guangxi Veterinary Research Institute; YNCIQ. Yunnan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau; CVCC. Chinese Veterinary Culture Collection Center

(轉(zhuǎn)下頁(yè)Carried forward)

2.2 敏感性試驗(yàn)

用建立的二重?zé)晒釸T-LAMP檢測(cè)FMDV和VSV 混合RNA標(biāo)準(zhǔn)品, 結(jié)果表明二重?zé)晒釸T-LAMP靈敏度可達(dá)100個(gè)拷貝混合模板·反應(yīng)-1，結(jié)果見(jiàn)圖3，A、B、C是電泳圖，D是實(shí)時(shí)濁度儀loopamLA-320C監(jiān)測(cè)副產(chǎn)物焦磷酸鎂曲線圖，可見(jiàn)該方法靈敏性高。

2.3 干擾性試驗(yàn)

對(duì)不同濃度模擬混合感染樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)模板濃度高而另一個(gè)模板濃度較低時(shí)，二重?zé)晒釸T-LAMP仍然可同時(shí)檢測(cè)到兩個(gè)模板(圖4)，不影響彼此擴(kuò)增效率，干擾性小。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)10份可疑牛樣品進(jìn)行檢測(cè)，二重?zé)晒釸T-LAMP和OIE推薦引物同時(shí)檢測(cè)到7份FMDV陽(yáng)性樣品，3份FMDV陰性樣品，0份VSV陽(yáng)性樣品(圖5)。該二重?zé)晒釸T-LAMP方法與OIE推薦方法檢測(cè)符合率100%，臨床效果好。

1、2、3、5、7、8、10. FMDV陽(yáng)性樣品；4、6、9. 陰性樣品1, 2, 3, 5, 7, 8, 10. FMDV positive samples; 4, 6, 9. Negative samples圖5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The results of clinical detection

3 討 論

LAMP是2000年T.Notomi等[9]開(kāi)發(fā)出的一種新型核酸擴(kuò)增方法，它恒溫?cái)U(kuò)增，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)快速，成本低，已廣泛應(yīng)用在疾病診斷和基因篩選上[11-12]。但由于LAMP最終結(jié)果的判定中，電泳全部是梯狀條帶，與PCR特異性目的條帶不同，沉淀物觀察、肉眼觀察顏色變化、紫外觀察顏色變化，LAMP檢測(cè)無(wú)論是單重還是多重，陽(yáng)性結(jié)果反映出來(lái)的結(jié)果都是一樣，不能確定具體到底是哪一種病原所引起的陽(yáng)性結(jié)果，所以進(jìn)行多重區(qū)分比較困難[13-14]。

目前國(guó)內(nèi)已有許多多重LAMP檢測(cè)方法的報(bào)道，但都有各自局限性，不能很好地應(yīng)用于臨床檢測(cè)。這些多重LAMP主要分為三種技術(shù)路線：① 將多套LAMP引物放入同一反應(yīng)管反應(yīng)，只能檢測(cè)樣品是否為陽(yáng)性，但不能區(qū)分具體是何種病原感染，檢測(cè)結(jié)果不明確[15-18]。② 僅借助LAMP的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，但仍依賴熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)后使用熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)熔解曲線峰出現(xiàn)的范圍不同判斷病原，對(duì)儀器設(shè)備要求高，耗時(shí)長(zhǎng)[19-23]。③ 對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，觀察目的片段大小的方法來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的判斷病原，方法步驟復(fù)雜，污染大，耗時(shí)長(zhǎng)[24-25]。本研究采取的是一種新的技術(shù)路線，首次借助熒光基團(tuán)，通過(guò)熒光基團(tuán)所顯示顏色的不同判斷結(jié)果，能準(zhǔn)確判斷病原[26]。其優(yōu)點(diǎn)如下，① 繼承了LAMP的優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件要求低，僅需一臺(tái)水浴鍋即可完成；反應(yīng)時(shí)間短，全程110 min即可，避免傳統(tǒng)PCR中反復(fù)升溫降溫所需在時(shí)間消耗；靈敏性好，多條引物同時(shí)擴(kuò)增，擴(kuò)增效率高，更靈敏；② 有效抑制假陽(yáng)性結(jié)果：由于熒光基團(tuán)鑲嵌在內(nèi)引物FIP上，擴(kuò)增過(guò)程中比普通引物更需要消耗能量，引物與模板DNA分子碰撞要求高，可以有效抑制假陽(yáng)性；③ 結(jié)果準(zhǔn)確：本研究使用了兩種新型熒光基團(tuán)，F(xiàn)ITC和CY5.5, 這兩種熒光基團(tuán)的激發(fā)光和吸收光均不同，因此可呈現(xiàn)不同的顏色，F(xiàn)ITC吸收波為520 nm，呈黃綠色，CY5.5吸收波為694 nm(但本研究在670 nm通道下觀察，依然準(zhǔn)確，不影響結(jié)果判斷)，呈大紅色。不同的熒光基團(tuán)，僅能在特定的通道下觀察到，即在520 nm通道下只能觀察到FITC顯色，無(wú)法觀察到CY5.5顯色。比僅憑沉淀物觀察、加染料肉眼觀察顏色變化等方式更準(zhǔn)確，是第一次實(shí)現(xiàn)了真正意義上的二重LAMP鑒別檢測(cè)。

本研究旨在鑒別檢測(cè)FMDV和VSV，若臨床使用中只要求檢測(cè)陽(yáng)性不合格樣品不需要區(qū)分這兩種病毒，可以使用加染料后，憑肉眼觀察顏色變化的方法判斷結(jié)果。在染料中，我們推薦使用鈣黃綠素為指示劑，鈣黃綠素原理：反應(yīng)前鈣黃綠素與氯化錳離子結(jié)合處于猝滅狀態(tài)，LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸離子與錳離子結(jié)合釋放鈣黃綠素，猝滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色光。鈣黃綠素、錳離子的濃度及兩者的比例對(duì)顯色效果影響較大，本研究經(jīng)試驗(yàn)推薦將300 μmol·L-1氯化錳與25 μmol·L-1鈣黃綠素按1∶10混勻作熒光染料工作液，每個(gè)反應(yīng)取1 μL熒光染料工作液與反應(yīng)試劑一起反應(yīng)，避免開(kāi)蓋污染。由于LAMP反應(yīng)產(chǎn)物是長(zhǎng)度不等的DNA片段，呈現(xiàn)大量梯狀條帶，Marker對(duì)這些片段的指示無(wú)意義，考慮成本原因，二重RT-LAMP電泳時(shí)不需要使用Marker。

4 結(jié) 論

設(shè)計(jì)了多套引物，優(yōu)化篩選特異性引物組合，最終成功建立了在同一反應(yīng)管鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重?zé)晒釸T-LAMP檢測(cè)方法。二重?zé)晒釸T-LAMP方法特異性好，能高效擴(kuò)增目的基因，而對(duì)其他病原核酸無(wú)擴(kuò)增，敏感性好，最低能檢測(cè)到100個(gè)混合模板拷貝·反應(yīng)-1。建立的FDMV和VSV二重?zé)晒釸T-LAMP方法是一種簡(jiǎn)便，快速，低成本的診斷方法，適用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

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