黃體期不同營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)湖羊卵泡發(fā)育及相關(guān)葡萄糖代謝途徑的影響

聶海濤，黃欣愛(ài)，劉 浩，郭藝璇，王子玉，張艷麗，萬(wàn)永杰，樊懿萱，張國(guó)敏，王 鋒*，王 潔*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 江蘇省肉羊產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，南京210095；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

黃體期短期營(yíng)養(yǎng)水平處理能夠顯著影響綿羊情期[1]，并推測(cè)卵泡內(nèi)葡萄糖是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量和卵泡發(fā)育能力的主要因素之一[2]。體外培養(yǎng)液中添加生糖物質(zhì)能夠顯著提高卵母細(xì)胞發(fā)育能力[3]。葡萄糖是顆粒細(xì)胞增殖分化最佳的能量底物，添加葡萄糖能夠增強(qiáng)顆粒細(xì)胞增殖和雌激素合成能力[4]。卵母細(xì)胞首先通過(guò)卵丘細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)系統(tǒng)吸收葡萄糖，再轉(zhuǎn)運(yùn)至卵母細(xì)胞[5]。葡萄糖作為卵泡發(fā)育的重要能量來(lái)源，其在卵泡細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑主要包括多元醇途徑(Polyol pathway)、糖酵解途徑(Glycolysis pathway)、己糖胺生物合成途徑(Hexosamine biosynthesis pathway)和磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway)，上述途徑共同參與調(diào)節(jié)能量供應(yīng)，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞核成熟等過(guò)程[6]。其中，糖酵解途徑是細(xì)胞糖代謝的主要能量供給途徑[7]，與卵母細(xì)胞發(fā)育能力正相關(guān)[8]，以丙酮酸和乳酸[9]或其他代謝中間產(chǎn)物的形式為卵泡發(fā)育直接[7]或間接[10]供能；糖酵解與卵母細(xì)胞發(fā)育能力正相關(guān)[8]。己糖胺代謝是主要的能量感應(yīng)通路，其關(guān)鍵限速酶透明質(zhì)酸合成酶 2(HAS2)的表達(dá)與卵母細(xì)胞發(fā)育能力密切相關(guān)[11]，透明質(zhì)酸酶是胞外基質(zhì)(ECM)基本骨架，而葡萄糖和葡萄糖胺是透明質(zhì)酸酶合成的主要底物[6]，并進(jìn)一步影響LH釋放波峰和表皮生長(zhǎng)因子/FSH的分泌[12]，參與卵巢周期性排卵過(guò)程，并已被證明參與介導(dǎo)了卵泡內(nèi)環(huán)境對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的應(yīng)答過(guò)程[13]。磷酸戊糖途徑為卵母細(xì)胞減數(shù)分裂各階段中核成熟和氧化還原反應(yīng)提供了必要的底物來(lái)源[14]，并被認(rèn)為其通過(guò)核質(zhì)成熟調(diào)控參與卵泡發(fā)育過(guò)程[8]。多元醇途徑的增強(qiáng)被認(rèn)為通過(guò)促進(jìn)山梨醇和果糖的胞內(nèi)累積等引發(fā)糖尿病[15]。葡萄糖途徑對(duì)卵丘卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和卵泡發(fā)育均具有重要的作用。此外，黃體溶解前補(bǔ)飼 4～6 d促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育，限飼抑制卵泡發(fā)育。黃體期卵泡更易閉鎖，而顆粒細(xì)胞凋亡對(duì)卵泡閉鎖具有重要的作用。補(bǔ)飼期升高的葡萄糖直接作用于卵巢，增加黃體溶解時(shí)逃脫閉鎖的卵泡數(shù)，進(jìn)而促進(jìn)卵泡發(fā)育。然而，黃體期營(yíng)養(yǎng)處理組試驗(yàn)羊發(fā)情周期、卵巢組織不同直徑卵泡分布、卵巢組織細(xì)胞凋亡率；卵泡細(xì)胞GLUT蛋白及葡萄糖代謝途徑中部分關(guān)鍵基因表達(dá)量的變化關(guān)系至今未有報(bào)道。本研究以葡萄糖代謝途徑中部分基因?yàn)檠芯繉?duì)象，探索其在不同營(yíng)養(yǎng)條件下在卵泡細(xì)胞中的表達(dá)情況，并分析其與卵泡發(fā)育和卵巢組織凋亡的關(guān)系，有助于進(jìn)一步探尋葡萄糖代謝在黃體期營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)綿羊卵泡發(fā)育的調(diào)控作用，豐富黃體期卵泡發(fā)育的“急性效應(yīng)”分子機(jī)制，為科學(xué)飼養(yǎng)空懷母羊，提高綿羊繁殖力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)與2015年10月-12月在江蘇省泰州市海倫羊業(yè)有限公司開(kāi)展，選擇體況良好，體重((43.69±1.27) kg)和月齡((29±4.5)月)相近的經(jīng)產(chǎn)湖羊30只，預(yù)飼7 d后，使用孕酮海綿栓埋置法進(jìn)行同期發(fā)情，12 d后下午撤栓并頸部皮下注射PGF2α(30 mg，寧波三生藥業(yè)有限公司)，次日清晨起使用經(jīng)調(diào)教的成年公羊進(jìn)行試情(06:00和18:00)，發(fā)情結(jié)束當(dāng)日定義為下一個(gè)情期的第0 天，參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)NY/T816-2004》中推薦的營(yíng)養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)，在隨后6 d對(duì)所有試驗(yàn)羊按照1.0倍維持需要量水平(1.09 kg·d-1)飼喂全價(jià)顆粒飼料(TMR，表1)，在此情期的第7～14天，將所有試驗(yàn)羊隨機(jī)分為1.0倍維持需要組(1.0M；1.09 kg·d-1)；0.5倍維持需要量組(0.5M；0.55 kg·d-1)，和1.5倍維持需要量組(1.5 M；1.65 kg·d-1)；第15天分別從3組隨機(jī)挑選屠宰6只試驗(yàn)羊，并取卵巢組織待用，剩下的12只湖羊按1.0倍維持需要量詞喂, 并對(duì)原有各組試驗(yàn)羊進(jìn)行發(fā)情鑒定觀察，用以統(tǒng)計(jì)發(fā)情周期。試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理完全參照由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理指南(SYXK 2011-0036)》中的相關(guān)動(dòng)物福利執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

表1 TMR日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Ingredient and chemical composition of the total mixed ration g·kg-1

1)預(yù)混料為每kg TMR日糧提供：維生素A 2 150 IU，維生素D 170 IU，維生素E 13 IU，F(xiàn)e 56 mg，Cu 15 mg，Mn 30 mg，Zn 40 mg，I 1.5 mg，Se 0.2 mg，Co 0.25 mg，S 3.2 g，硫酸鈉10.1 g，其余為稀釋劑和載體物質(zhì)(蒙脫石)
1)The premix provided the following per kg of the TMR diet: Vitamin A 2 150 IU, Vitamin D 170 IU, Vitamin E 13 IU, Fe 56 mg, Cu 15 mg, Mn 30 mg, Zn 40 mg, I 1.5 mg, Se 0.2 mg, Co 0.25 mg, S 3.2 g, Sodium sulfate 10.1 g, the remainder are diluents and carrier substances (montmorillonite)

1.2 卵巢組織處理

屠宰后摘取卵巢組織，用低溫生理鹽水沖洗3遍 以上，置于裝有冰預(yù)冷D-PBS的塑料培養(yǎng)皿中，隨機(jī)選取一側(cè)卵巢在體視鏡下使用眼科剪鑷鈍性剝除其結(jié)締組織，并根據(jù)方格紙柵格測(cè)量結(jié)果，分離直徑>1.0 mm的卵泡，放入含D-PBS的塑料培養(yǎng)皿中，剝離下的可視卵泡根據(jù)其卵泡直徑進(jìn)一步分為<2.5 mm和≥2.5 mm卵泡兩個(gè)大小等級(jí)，隨后將剝離下的卵泡用眼科剪對(duì)半剖開(kāi)，使用接種環(huán)沿卵泡內(nèi)壁刮下卵泡細(xì)胞，連同卵泡液一同置于含紅細(xì)胞裂解液的預(yù)冷PBS中,孵育3～5 min，隨后將每只試驗(yàn)羊同大小等級(jí)卵泡緩慢移入2 mL離心管中，4 ℃13 000 r·min-1離心10 min，-20 ℃保存待用。每頭羊卵泡液在30 min內(nèi)分離完成，且在生物冰上操作。另一側(cè)卵巢組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋, 4 μm切片待檢。

1.3 卵巢組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：11684817910, 羅氏, 美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)卵巢組織細(xì)胞凋亡情況。通過(guò)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞核染色的棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。經(jīng) TUNEL 染色及蘇木精復(fù)染后凋亡細(xì)胞核呈棕色，正常細(xì)胞核染藍(lán)色。結(jié)果根據(jù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，每張切片拍攝10個(gè)陽(yáng)性視野，每視野記數(shù)30個(gè)卵泡細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以平均計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比作為細(xì)胞凋亡率(Apoptosis rate，AR)，相應(yīng)的結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

將石蠟切片梯度脫蠟脫水，隨后抗原修復(fù)液在微波爐內(nèi)高火煮沸，然后將切片放入其中，中低火修復(fù)10 min后，自然冷卻至室溫，3%甲醇-H2O2孵育20 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶的活性,蒸餾水沖洗, PBS浸洗5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15 min，分別滴加GLUT-4(博士德生物科技有限公司，武漢)蛋白多克隆抗體, 4 ℃孵育過(guò)夜(對(duì)照組用1% BSA代替)，用0.1% PBST洗滌，滴加二抗37 ℃孵育2 h，隨后使用0.05% DAB和0.01% H2O2混合顯色3 min(根據(jù)具體著色情況可適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)顯色時(shí)間)，隨后對(duì)所有石蠟切片進(jìn)行脫水透明處理并用中性樹(shù)脂封片，干燥后觀察。

1.5 Western blot檢測(cè)

用RIPA裂解法提取卵巢組織蛋白，并應(yīng)用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度；根據(jù)所測(cè)濃度用RIPA裂解液調(diào)節(jié)蛋白濃度，保證各樣品的蛋白濃度一致，進(jìn)行蛋白變性，變性后蛋白置于-20 ℃保存。將蛋白樣品使用上樣緩沖液進(jìn)行稀釋(>1.5 μg·μL-1)，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求分別進(jìn)行分離膠和濃縮膠的制備，膠孔加樣20 μL的蛋白樣本，在聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(SDS-PAGE)中分別電泳30和120 min，剪取PVDF膜，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中完成整個(gè)轉(zhuǎn)膜過(guò)程。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入預(yù)先加入2 mL 5%的BSA的自封袋中，封口，置于搖床上，室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，加入2 mL GLUT4一抗(1∶750稀釋；貨號(hào)：21619；南京建成生物工程研究所)，封口，置于搖床上，4 ℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜5次，放入新的自封袋中，加入2 mL稀釋好的二抗(1∶1 000，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)，置于搖床上，室溫孵育2 h。TBST洗膜5次后加入適量ECL顯影液，避光靜置2 min后，用Image Quant LAS 4000儀器進(jìn)行顯影。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量分析

按照羅氏試劑盒說(shuō)明，提取卵泡細(xì)胞總RNA，取2.5 μL RNA樣品，在微量分光光度計(jì)下測(cè)定樣本的OD值及總RNA濃度。以制備的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)合成的特異性引物(表2)，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增目的基因，檢測(cè)卵巢組織中HAS2、AR、ECM1、G6PDH、GFPT1、GFPT2、HK1、OGT、PFK、SDHmRNA的表達(dá)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，β-actin為內(nèi)參基因，基因的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析。使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異顯著。反應(yīng)體系：2 μL cDNA、10 μL SYBR green PCR master mix，6.8 μL 雙蒸水，上下游引物各0.6 μL，共計(jì)20 μL；反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，不同試驗(yàn)組試驗(yàn)羊的發(fā)情周期、卵巢組織凋亡率、卵泡細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平和Western blot等數(shù)據(jù)采用One-way方差分析(Duncan’s 法多重比較)；不同大小卵泡數(shù)采用卡方分析(Fisher’s 精確檢驗(yàn))。

表2 熒光定量PCR引物信息Table 2 Information of quantitative PCR primer sequences

2 結(jié) 果

2.1 黃體期營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)發(fā)情周期及卵泡發(fā)育的影響

黃體期不同營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)試驗(yàn)羊發(fā)情周期和不同直徑卵泡數(shù)量的影響見(jiàn)表3。0.5M組試驗(yàn)羊的平均發(fā)情周期為(19.25±0.48)d，顯著高于1.0M組((17.75±0.63)d)和1.5M組((17.25±0.48)d；P<0.05)，該結(jié)果表明，黃體期0.5倍維持需要量飼喂水平顯著抑制了湖羊的發(fā)情。此外，營(yíng)養(yǎng)水平處理顯著影響了卵巢組織大卵泡(卵泡直徑：≥ 2.5 mm)和小卵泡(卵泡直徑：1.0～2.5 mm)數(shù)量，其中0.5M組試驗(yàn)羊大卵泡和小卵泡數(shù)量分別顯著低于和高于1.0M與1.5M組(P<0.05)；但3組試驗(yàn)羊總卵泡數(shù)差異不顯著(卵泡直徑：≥ 1.0 mm)，此外，0.5M組試驗(yàn)羊小卵泡數(shù)/總卵泡數(shù)、大卵泡/總卵泡數(shù)分別高于和低于1.0M與1.5M組(P<0.05)。

2.2 黃體期不同飼喂水平對(duì)卵巢組織細(xì)胞凋亡的影響

黃體期營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)卵巢組織細(xì)胞凋亡的影響如圖1所示；結(jié)果表明，0.5M組試驗(yàn)羊卵巢組織顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)(29.50%±2.37%)顯著高于1.0M(11.11%±1.68%)與1.5M組(10.16%±1.82%；P<0.05)。

2.3 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在卵巢組織中的定位及其在卵泡細(xì)胞中的定量研究

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(GLUT4)在卵巢組織中的表達(dá)定位見(jiàn)圖2，如圖2所示，GLUT4蛋白主要在原始和初級(jí)卵泡(圖2A)、次級(jí)卵泡(圖2B)卵母細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)；在三級(jí)卵泡(圖2C)和排卵前卵泡(圖2D和E)顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞中均有表達(dá)。GLUT4在不同營(yíng)養(yǎng)水平試驗(yàn)羊卵巢組織<2.5 mm及≥2.5 mm卵泡中的表達(dá)變化情況如圖3所示，對(duì)0.5M和1.0M組而言，GLUT4蛋白表達(dá)量隨卵泡直徑的增加而顯著升高(P<0.05)，其在1.5M組不同直徑卵泡間差異不顯著(P>0.05)；且1.5M組<2.5 mm卵泡中GLUT4蛋白表達(dá)量顯著高于1.0M 和0.5M組(P<0.05)，但不同營(yíng)養(yǎng)水平組在≥2.5 mm卵泡中GLUT4蛋白表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

表3 黃體期不同營(yíng)養(yǎng)水平飼喂試驗(yàn)羊發(fā)情周期及卵巢組織不同大小卵泡數(shù)量情況Table 3 Estrous cycle and distribution of the ovarian follicles from ewes under different nutritional treatments during the luteal phase

同行不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)
The different small letters within the same row indicate significant difference (P<0.05)

A.不同營(yíng)養(yǎng)水平處理試驗(yàn)羊卵巢TUNEL檢測(cè)結(jié)果；B.卵巢細(xì)胞凋亡指數(shù)(▲.0.5M組；●.1.5M組；■.1.0M組)；*.P<0.05A.TUNEL results of ovarian from ewes among different nutritional treatments；B.Apoptosis index (▲. 0.5M group；●. 1.5M group; ■.1.0M group); *.P<0.05圖1 不同營(yíng)養(yǎng)水平組湖羊卵巢細(xì)胞凋亡Fig.1 Cell apoptosis of ovarian in different nutrient treatments

A.初級(jí)卵泡；B.次級(jí)卵泡；C.三級(jí)卵泡；D.排卵前卵泡;F.D中長(zhǎng)方形框標(biāo)注所在區(qū)域的高倍視野下的排卵前卵泡；E.空白對(duì)照。EN. 卵母細(xì)胞巢；G.顆粒細(xì)胞；T.膜細(xì)胞A.The primordial follicle (pr) and primary follicle (pm); B. The secondary follicle; C.The tertiary follicle; D.The preovulatory follicle; F. The preovulatory follicle in the higher multiples of vision based on the frame marked area within the D; E.Blank control. EN. Egg nests; G.Granulosa cells; T.Thecal cells圖2 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)在卵巢組織中的定位(A、B、C、D和E 100×；F 200×)Fig.2 Immunohistochemical localization glucose transporter 4 (GLUT4) in ovarian tissues (A, B, C, D and E 100×；F 200×)

A.GLUT4在不同營(yíng)養(yǎng)水平處理組試驗(yàn)羊不同直徑卵泡細(xì)胞Western blot檢測(cè)結(jié)果；B.GLUT4蛋白表達(dá)量；*.相同卵泡直徑中不同營(yíng)養(yǎng)水平處理組卵泡GLUT4表達(dá)差異顯著(P<0.05)；Φ.相同營(yíng)養(yǎng)水平處理組中不同直徑卵泡GLUT4表達(dá)差異顯著(P<0.05)A.Western blot band of GLUT4 within different follicle size of ewes under different nutritional treatments; B.GLUT4 protein expression levels; *.Significant differences of GLUT4 expression between different nutrient levels within the same follicle size (P<0.05); Φ.Significant differences of GLUT4 expression between different follicle sizes within the same nutrient level (P<0.05)圖3 黃體期營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)卵泡細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of nutrient levels treatment during luteal phase on glucose transporter 4 (GLUT4) expression in follicular cells

2.4 糖代謝途徑關(guān)鍵基因在卵泡細(xì)胞中的表達(dá)情況

黃體期營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)不同直徑卵泡細(xì)胞糖代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響如圖4所示：本研究中所檢測(cè)的卵泡細(xì)胞HAS2、ECM1、AR、GFPT1、HK1、OGT、PFK、SDH的基因表達(dá)量在<2.5 mm和≥2.5 mm卵泡細(xì)胞中的表達(dá)量在不同營(yíng)養(yǎng)水平處理組間差異均不顯著(P>0.05)；己糖胺途徑關(guān)鍵酶GFPT2基因表達(dá)量在不同直徑卵泡中隨營(yíng)養(yǎng)水平變化趨勢(shì)完全相反，表現(xiàn)為<2.5 mm卵泡中隨采食量水平升高而降低(P<0.05)，而其在≥2.5 mm卵泡中則隨采食量水平的升高而顯著升高(P<0.05)；此外，0.5M組≥2.5 mm卵泡細(xì)胞的戊糖磷酸途徑關(guān)鍵酶G6PDH基因顯著低于1.0M組和1.5M組(P<0.05)，而不同營(yíng)養(yǎng)水平組G6PDH基因表達(dá)量在<2.5 mm卵泡中差異不顯著(P> 0.05)。

3 討 論

隨著細(xì)胞凋亡研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到次級(jí)卵泡的閉鎖主要是顆粒細(xì)胞的凋亡所致[16]。由細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞死亡已在小鼠[17], 奶牛[18], 綿羊[19]和豬[20]等物種證實(shí)。 在哺乳動(dòng)物黃體期卵泡發(fā)育過(guò)程中，僅有少數(shù)卵泡能夠逃脫閉鎖命運(yùn)而發(fā)育至排卵。卵泡閉鎖最初表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，到了閉鎖后期，大量的顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，顆粒細(xì)胞碎片充滿整個(gè)卵泡液。本研究結(jié)果表明，0.5M組試驗(yàn)羊卵巢卵泡中細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于1.0M和1.5M組，由此推測(cè)黃體期營(yíng)養(yǎng)限飼對(duì)湖羊卵泡發(fā)育的影響與卵泡細(xì)胞凋亡有關(guān)。

葡萄糖是卵泡發(fā)育的能量和代謝底物來(lái)源[21]。機(jī)體攝入的葡萄糖需通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白(GLUTs)。其中，GLUT4被認(rèn)為是具有胰島素依賴性、具有較強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的功能性蛋白[22]。本研究結(jié)果顯示，0.5M組試驗(yàn)羊發(fā)情延遲，其在卵泡分級(jí)和不同直徑卵泡分布上表現(xiàn)為<2.5 mm卵泡數(shù)量的增多和≥2.5 mm卵泡數(shù)量的減少，提示0.5倍維持營(yíng)養(yǎng)水平限飼可能抑制了<2.5 mm卵泡向≥2.5 mm卵泡的發(fā)育；結(jié)合GLUT4蛋白在不同營(yíng)養(yǎng)水平和不同直徑卵泡細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化，筆者進(jìn)一步猜測(cè)<2.5 mm卵泡發(fā)育的抑制很有可能與GLUT4在<2.5 mm卵泡細(xì)胞表達(dá)量的下調(diào)有關(guān)，同時(shí)已有研究表明黃體期低飼喂水平通過(guò)上調(diào)血液孕酮、雌二醇、孕酮與雌二醇比值和FSH水平抑制卵泡發(fā)育[23]，由此，筆者推測(cè)黃體期營(yíng)養(yǎng)限飼對(duì)卵泡發(fā)育的抑制很可能與卵泡細(xì)胞的雌激素分泌能力差異有關(guān)。然而，不同營(yíng)養(yǎng)水平組試驗(yàn)羊≥2.5 mm 卵泡細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異，提示卵泡細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)隨營(yíng)養(yǎng)水平的表達(dá)變化模式存在卵泡發(fā)育階段依賴性，筆者認(rèn)為在營(yíng)養(yǎng)負(fù)平衡飼喂條件下，機(jī)體優(yōu)先滿足優(yōu)勢(shì)或亞優(yōu)勢(shì)卵泡的葡萄糖需要，本研究所得卵泡細(xì)胞GLUT4蛋白隨卵泡直徑增加的上升的結(jié)果也為上述猜測(cè)提供了依據(jù)。

己糖胺合成通路(HBP)被認(rèn)為能量狀態(tài)的“傳感器”[24]，6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-phosphate)經(jīng)HBP途徑代謝為6-磷酸果糖(Fructose-6-phosphate)，并在谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)移酶(Glucosamine:fructose-6-phosphate transaminase；GFPT)的催化下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖胺(Glucosamine-6-phosphate)，并最終生成細(xì)胞的重要糖基供體(UDP-N-乙酰葡糖胺)。HBP途徑在正常體細(xì)胞糖代謝總量中的占比僅為1%～3%，UDP-N-乙酰葡糖胺除作為糖基供體參與能量供給外，還能夠在透明質(zhì)酸合酶(HAS)催化作用下生成的透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid)是卵丘細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要骨架結(jié)構(gòu)。已有研究發(fā)現(xiàn)，卵丘細(xì)胞中HAS表達(dá)量與卵母細(xì)胞發(fā)育能力的增強(qiáng)有直接關(guān)系[11]；此外，UDP-N-乙酰葡糖胺還能在O-連接糖基化酶(OGT)催化下發(fā)生O-聯(lián)糖基化，進(jìn)而通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)與分化等多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程參與卵泡發(fā)育[25]。本研究中，OGT和HAS2基因在不同直徑卵泡和不同營(yíng)養(yǎng)水平處理組表達(dá)量均無(wú)差異，表明黃體期營(yíng)養(yǎng)水平處理并未影響卵泡細(xì)胞在O-聯(lián)糖基化和透明質(zhì)酸合成過(guò)程。但作為HBP途徑的另一關(guān)鍵限速酶，GFPT2基因在≥2.5mm卵泡細(xì)胞中的表達(dá)量隨營(yíng)養(yǎng)水平的升高而顯著升高，而<2.5mm卵泡中該基因隨營(yíng)養(yǎng)水平的變化趨勢(shì)卻與之完全相反。由此推測(cè)，GFPTs基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)反映了卵泡細(xì)胞的HBP途徑對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平應(yīng)答在不同直徑卵泡間存在差異，且主要表現(xiàn)在6-磷酸葡萄糖胺和UDP-N-乙酰葡糖胺等反應(yīng)中間產(chǎn)物催化效率的差異。GFPT抑制劑(6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸)能夠顯著降低卵丘細(xì)胞葡萄糖攝入量和增殖速率，該結(jié)果也佐證了本研究對(duì)HBP途徑可能參與調(diào)控卵泡發(fā)育的急性營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制的推測(cè)。綿羊黃體期注射葡萄糖胺能夠顯著增加大卵泡數(shù)[26]，促進(jìn)主動(dòng)脈平滑肌IGFβ[27]以及骨骼肌TGFα基因表達(dá)[28]，通過(guò)抑制芳香化酶的表達(dá)[29]和雌二醇的分泌[30]參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育，上述過(guò)程可能與本研究1.5M營(yíng)養(yǎng)水平處理對(duì)試驗(yàn)羊≥2.5mm卵泡發(fā)育的促進(jìn)有關(guān)，進(jìn)而表現(xiàn)為該組試驗(yàn)羊≥2.5mm卵泡數(shù)量的增加。

*.相同卵泡直徑中不同營(yíng)養(yǎng)水平處理組卵泡基因表達(dá)差異顯著(P<0.05)；Φ.相同營(yíng)養(yǎng)水平處理組中不同直徑卵泡基因表達(dá)差異顯著(P<0.05)*.Significant differences of genes expression between different nutrient levels within the same follicle size (P<0.05);Φ.Significant differences of genes expression between different follicle sizes within the same nutrient level (P<0.05)圖4 黃體期營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)卵泡細(xì)胞糖代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of nutrient levels treatment during luteal phase on key genes involved in glucose metabolic pathway of follicular cells

磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway；PPP)是葡萄糖氧化分解的主要方式之一，由氧化和非氧化過(guò)程組成，所攝入的葡萄糖能夠以氧化和非氧化反應(yīng)的形式參與到PPP中。作為磷酸戊糖途徑的第一限速酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)在卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中表達(dá)量有所不同，在牛上，卵母細(xì)胞G6PDH表達(dá)量顯著高于卵丘細(xì)胞[31]。本研究中，在1.0M和1.5M組中，G6PDH基因在≥2.5 mm卵泡細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于<2.5 mm卵泡細(xì)胞，這可能維持需要以上飼喂水平試驗(yàn)羊卵巢組織中較大直徑卵泡中未成熟卵母細(xì)胞的質(zhì)量提高、卵母細(xì)胞核成熟比例增加有關(guān)[32]，然而，0.5M組試驗(yàn)羊G6PDH基因表達(dá)量在不同直徑卵泡細(xì)胞表達(dá)量卻無(wú)顯著差異，基于上述理論，筆者推測(cè)0.5M組不同直徑卵泡細(xì)胞在卵母細(xì)胞質(zhì)量，核成熟比例上亦無(wú)顯著差異，也側(cè)面驗(yàn)證前文中提及的營(yíng)養(yǎng)限飼抑制了卵泡由<2.5 mm向≥2.5 mm進(jìn)一步發(fā)育的推論。此外，作為PPP途徑的主要產(chǎn)物，NADPH作為還原劑、氫負(fù)離子的供體能夠?qū)⒀趸凸入赘孰?GSSG)轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽(GSH)，從而發(fā)揮清除體內(nèi)自由基維持氧化平衡的生物學(xué)功能[6]，因此，PPP途徑的增強(qiáng)對(duì)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力具有正調(diào)控效應(yīng)。本研究結(jié)果表明，0.5M限飼顯著降低了G6PDH基因在≥2.5 mm卵泡中的表達(dá)量，但其在<2.5 mm卵泡中的表達(dá)量無(wú)顯著差異，由此推測(cè)黃體期限飼特異性導(dǎo)致≥2.5 mm卵泡氧化應(yīng)激的發(fā)生，與此類似，在利用3-硝基丙酸誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的在體小鼠模型中，與中等和小直徑卵泡相比，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)組大直徑卵泡閉鎖率更高，更易受到氧化應(yīng)激的影響[33]。因此，筆者進(jìn)一步推測(cè)PPP通路極有可能更傾向于在大直徑卵泡中發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)應(yīng)答效應(yīng)，且此效應(yīng)很可能與氧化應(yīng)激發(fā)生有關(guān)。

4 結(jié) 論

黃體期0.5M限飼導(dǎo)致湖羊發(fā)情延遲；此過(guò)程很可能與其卵巢細(xì)胞凋亡率的升高，<2.5mm卵泡細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)量的降低和HBP途徑的增強(qiáng)，以及≥ 2.5 mm卵泡細(xì)胞中HBP途徑的減弱和PPP途徑的增強(qiáng)等有關(guān)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] 應(yīng)詩(shī)家, 王昌龍, 賈若欣, 等. 湖羊不同發(fā)育階段卵泡內(nèi)代謝產(chǎn)物和激素含量的比較研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 43(2): 180-185.

YING S J, WANG C L, JIA R X, et al. A comparative study of metabolites and hormone concentrations in different sized follicles in Hu sheep[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2012, 43(2): 180-185. (in Chinese)

[2] NANDI S, GIRISH K V, MANJUNATHA B M, et al. Follicular fluid concentrations of glucose, lactate and pyruvate in buffalo and sheep, and their effects on cultured oocytes, granulosa and cumulus cells[J].Theriogenology, 2008, 69(2): 186-196.

[3] BERLINGUER F, GONZALEZ-BULNES A, CONTRERAS-SOLIS I, et al. Glucogenic supply increases oocyte developmental competence in sheep[J].ReprodFertilDev, 2012, 24(8): 1055-1062.

[4] CAMPBELL B K, ONIONS V, KENDALL N R, et al. The effect of monosaccharide sugars and pyruvate on the differentiation and metabolism of sheep granulosa cellsinvitro[J].Reproduction, 2010, 140(4): 541-550.

[5] WANG Q, CHI M M, SCHEDL T, et al. An intercellular pathway for glucose transport into mouse oocytes[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2012, 302(12): E1511-E1518.

[6] SUTTON-MCDOWALL M L, GILCHRIST R B, THOMPSON J G. The pivotal role of glucose metabolism in determining oocyte developmental competence[J].Reproduction, 2010, 139(4): 685-695.

[7] HARRIS S E, LEESE H J, GOSDEN R G, et al. Pyruvate and oxygen consumption throughout the growth and development of murine oocytes[J].MolReprodDev, 2009, 76(3): 231-238.

[8] DOWNS S M, UTECHT A M. Metabolism of radiolabeled glucose by mouse oocytes and oocyte-cumulus cell complexes[J].BiolReprod, 1999, 60(6): 1446-1452.

[9] HARRIS S E, ADRIAENS I, LEESE H J, et al. Carbohydrate metabolism by murine ovarian follicles and oocytes growninvitro[J].Reproduction, 2007, 134(3): 415-424.

[10] HERRICK J R, BRAD A M, KRISHER R L. Chemical manipulation of glucose metabolism in porcine oocytes: Effects on nuclear and cytoplasmic maturationinvitro[J].Reproduction, 2006, 131(2): 289-298.

[11] ASSIDI M, DUFORT I, ALI A, et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetateinvitro[J].BiolReprod, 2008, 79(2): 209-222.

[12] BUCCIONE R, VANDERHYDEN B C, CARON P J, et al. FSH-induced expansion of the mouse cumulus oophorusinvitrois dependent upon a specific factor(s) secreted by the oocyte[J].DevBiol, 1990, 138(1): 16-25.

[13] SCARAMUZZI R J, BROWN H M, DUPONT J. Nutritional and metabolic mechanisms in the ovary and their role in mediating the effects of diet on folliculogenesis: A perspective[J].ReprodDomestAnim, 2010, 45(S3): 32-41.

[14] SUTTON-MCDOWALL M L, GILCHRIST R B, THOMPSON J G. Effect of hexoses and gonadotrophin supplementation on bovine oocyte nuclear maturation duringinvitromaturation in a synthetic follicle fluid medium[J].ReprodFertilDev, 2005, 17(4): 407-415.

[15] CHUNG S S M, HO E C M, LAM K S L, et al. Contribution of polyol pathway to diabetes-induced oxidative stress[J].JAmSocNephrol, 2003, 14(S3): S233-S236.

[16] 梁學(xué)超, 蔣 明, 羅玉茹, 等. 豬卵巢發(fā)育的組織學(xué)變化及卵泡閉鎖規(guī)律研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2017, 48(10): 1863-1870.

LIANG X C, JIANG M, LUO Y R, et al. Study on histology and patterns of follicular atresia during ovarian development in pig[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2017, 48(10): 1863-1870. (in Chinese)

[17] HUGHES F M Jr, GOROSPE W C. Biochemical identification of apoptosis (programmed cell death) in granulosa cells: Evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia[J].Endocrinology, 1991, 129(5): 2415-2422.

[18] JOLLY P D, TISDALL D J, HEATH D A, et al. Apoptosis in bovine granulosa cells in relation to steroid synthesis, cyclic adenosine 3′, 5′-monophosphate response to follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone, and follicular atresia[J].BiolReprod, 1994, 51(5): 934-944.

[19] MURDOCH W J. Programmed cell death in preovulatory ovine follicles[J].BiolReprod, 1995, 53(1): 8-12.

[20] SUGIMOTO M, MANABE N, KIMURA Y, et al. Ultrastructural changes in granulosa cells in porcine antral follicles undergoing atresia indicate apoptotic cell death[J].JReprodDev, 1998, 44(1): 7-14.

[21] DOWNING J A, SCARAMUZZI R J. Nutrient effects on ovulation rate, ovarian function and the secretion of gonadotrophic and metabolic hormones in sheep[J].JReprodFertilSuppl, 1991, 43: 209-227.

[22] WILLIAMS S A, BLACHE D, MARTIN G B, et al. Effect of nutritional supplementation on quantities of glucose transporters 1 and 4 in sheep granulosa and theca cells[J].Reproduction, 2001, 122(6): 947-956.

[23] YING S J, WANG Z Y, WANG C L, et al. Effect of different levels of short-term feed intake on folliculogenesis and follicular fluid and plasma concentrations of lactate dehydrogenase, glucose, and hormones in Hu sheep during the luteal phase[J].Reproduction, 2011, 142(5): 699-710.

[24] MARSHALL S, BACOTE V, TRAXINGER R R. Discovery of a metabolic pathway mediating glucose-induced desensitization of the glucose transport system. Role of hexosamine biosynthesis in the induction of insulin resistance[J].JBiolChem, 1991, 266(8): 4706-4712.

[25] WELLS L, WHELAN S A, HART G W. O-GlcNAc: A regulatory post-translational modification[J].BiochemBiophysResCommun, 2003, 302(3): 435-441.

[27] MCCLAIN D A, PATERSON A J, ROOS M D, et al. Glucose and glucosamine regulate growth factor gene expression in vascular smooth muscle cells[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1992, 89(17): 8150-8154.

[28] DANIELS M C, KANSAL P, SMITH T M, et al. Glucose regulation of transforming growth factor-alpha expression is mediated by products of the hexosamine biosynthesis pathway[J].MolEndocrinol, 1993, 7(8): 1041-1048.

[29] HARLOW C R, CAHILL D J, MAILE L A, et al. Time-dependent effects of transforming growth factor α on aromatase activity in human granulosa cells[J].HumReprod, 1995, 10(10): 2554-2559.

[30] SCARAMUZZI R J, DOWNING J A. Theinvivoeffects of fibroblast growth factor and epidermal growth factor on the secretion of oestradiol, androstenedione and progesterone by the autotransplanted ovary in the ewe[J].JEndocrinol, 1995, 146(2): 301-311.

[31] CETICA P, PINTOS L, DALVIT G, et al. Activity of key enzymes involved in glucose and triglyceride catabolism during bovine oocyte maturationinvitro[J].Reproduction, 2002, 124(5): 675-681.

[32] 郭延華, 周 平, 石國(guó)慶, 等. 綿羊不同直徑卵泡卵母細(xì)胞特征及染色體形態(tài)分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 49(7): 1307-1314.

GUO Y H, ZHOU P, SHI G Q, et al. The characteristics of ovine oocytes from different diameter follicles and chromatin configuration analysis[J].XinjiangAgriculturalScience, 2012, 49(7): 1307-1314. (in Chinese)

[33] ZHANG J Q, SHEN M, ZHU C C, et al. 3-nitropropionic acid induces ovarian oxidative stress and impairs follicle in mouse[J].PLoSOne, 2014, 9(2): e86589.