轉(zhuǎn)錄因子PAX4調(diào)控湖羊FSHR基因轉(zhuǎn)錄活性

王德迪，李隱俠，姚一龍，潘增祥，決 肯，依 明，曹少先，李齊發(fā)*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

促卵泡素受體(Follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)是雌性哺乳動物卵巢顆粒細(xì)胞膜上一種重要的受體蛋白，其編碼基因是影響哺乳動物多胎性狀的主效基因，調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞狀態(tài)(增殖和凋亡)、卵泡發(fā)育和排卵[1-2]。促卵泡素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必須通過與卵巢顆粒細(xì)胞膜上的受體FSHR結(jié)合才能作用于卵巢，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育、調(diào)控配子形成[3]，因此FSHR是母畜生殖必需的。研究發(fā)現(xiàn)豬卵泡成熟與排卵依賴FSHR基因的表達(dá)[4]，其基因編碼區(qū)上3個 堿基突變(c.74C>G、c.532G>A和c.1166T>C)顯著影響豬排卵數(shù)，F(xiàn)SHR被認(rèn)為是影響豬繁殖性狀的主效基因[1]。在綿羊中，F(xiàn)SHR基因在卵巢組織不同大小(直徑4～7 mm)和不同狀態(tài)(優(yōu)勢卵泡、劣勢卵泡和黃體化卵泡)的卵泡中均差異表達(dá)[5]，說明FSHR基因表達(dá)水平與綿羊卵泡發(fā)育、優(yōu)勢化和排卵有關(guān)。FSHR基因5′-調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)SNP位點(g.-414G>A、g.-200G>A、g.-197G>A、g.-98T>C、g.-47C > T和c.1235T>C)的多態(tài)性均與綿羊多胎性狀(產(chǎn)羔數(shù))顯著關(guān)聯(lián)[6-9]。因此，F(xiàn)SHR是影響綿羊多胎性狀的重要候選基因。

湖羊是中國著名的多胎綿羊品種，其多胎機制一直是湖羊特色性狀研究和應(yīng)用的熱點[6, 10-12]。FSHR基因SNP位點多態(tài)性與湖羊多胎性狀之間關(guān)系密切[13]，是影響湖羊多胎性狀的候選基因。在高繁殖力綿羊個體卵巢卵泡中，F(xiàn)SHR基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于低繁殖力個體[5,14]，可見卵泡中FSHR基因表達(dá)水平與綿羊繁殖力有關(guān)。但目前關(guān)于綿羊FSHR基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究較少，特別是轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控還未見報道。本研究擬以湖羊FSHR基因為研究對象，克隆湖羊FSHR基因5′-UTR序列，了解其序列特征(如轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)，分析湖羊轉(zhuǎn)錄因子PAX4基因的組織表達(dá)特征和在卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中的作用，以及對湖羊FSHR基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，以期揭示湖羊FSHR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制和湖羊多胎分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

成年湖羊母羊(n=3)心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、大腸、小腸、子宮和卵巢11種組織樣采自蘇州種羊場，置于液氮中保存，用于提取DNA和RNA。

1.2 核酸提取

采用酚/氯仿法提取湖羊卵巢組織DNA。采用Trizol(Invitrogen公司)法提取湖羊各組織和卵巢顆粒細(xì)胞總RNA，并利用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。DNA和cDNA均在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 克隆測序

以綿羊FSHR基因序列(GenBank序列號：NC_019460.1)為參考序列，設(shè)計引物P1用于擴增湖羊FSHR基因5′-UTR序列，引物信息和擴增條件見表1。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，并采用膠回收試劑盒(Axygen公司)進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物與載體pMD19-T(TaKaRa公司)連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α(天根公司)中；挑取陽性克隆，采用質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen公司)提取質(zhì)粒，由上海生物工程公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 序列分析

采用DNAMAN v5.2.2軟件進(jìn)行序列整理和比對分析；采用在線程序Genomatix(https://www.genomatix.de)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測；采用在線軟件Methprimer(http://www.urogene.org)預(yù)測CpG島。

1.5 組織表達(dá)譜

以湖羊11個組織cDNA為模板，以P2(表1)為引物進(jìn)行RT-PCR擴增。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，用Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)拍照。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用Quantity One v4.52軟件對目的基因和內(nèi)參基因進(jìn)行灰度分析，用目的基因/內(nèi)參基因計算不同組織目的基因的相對表達(dá)量。

1.6 載體構(gòu)建

湖羊PAX4基因過表達(dá)載體pcDNA3.1-PAX4由南京伯津公司合成，采用雙酶切鑒定法和直接測序進(jìn)行確認(rèn)。以P4(表1)為引物擴增湖羊FSHR基因5′-UTR，用限制性內(nèi)切酶KpnI和Hind Ⅲ酶切后，克隆到pGL3雙熒光素酶報告基因載體(Promega公司)中，并轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞DH5α(天根公司)，采用雙酶切鑒定法和直接測序進(jìn)行確認(rèn)，構(gòu)建湖羊FSHR基因5′-UTR熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性分析

商品豬卵巢采自南京天環(huán)屠宰場，用于抽取卵巢顆粒細(xì)胞。豬卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性分析的具體方法見文獻(xiàn)[2]。

1.8 qRT-PCR

pcDNA3.1-PAX4轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。卵巢顆粒細(xì)胞中PAX4基因表達(dá)水平采用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，具體步驟見文獻(xiàn)[11]，退火溫度見表1。

表1 引物信息Table 1 The primers in this study

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS v18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 湖羊FSHR基因5′調(diào)控區(qū)克隆

以湖羊卵巢組織基因組DNA為模板，利用引物P1進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，電泳條帶單一明亮。測序發(fā)現(xiàn)，擴增片段長度為730 bp，與引物源序列(GenBank序列號：NC_019460.1)的一致性為98.99%。

M.DL2000 marker；1～2.PCR擴增產(chǎn)物M.DL2000 marker; 1-2.PCR product圖1 湖羊FSHR基因5′調(diào)控區(qū)擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel photograph of FSHR 5′ regulatory region in Hu sheep

2.2 湖羊FSHR基因5′-UTR序列分析

湖羊FSHR基因5′-UTR序列全長161 bp(圖2)。序列分析發(fā)現(xiàn)，湖羊FSHR基因5′-UTR序列中A、T、C和G等4種堿基的含量分別是32.30%、16.77%、21.74%和29.19%，其中A+T含量(49.07%)接近C+G含量(50.93%)。同源性比對發(fā)現(xiàn)，湖羊FSHR基因5′-UTR序列與特塞爾(Texel)綿羊序列(GenBank序列號：NC_019460.1)一致，與牛(GenBank序列號：AC_000168.1)、小鼠(GenBank序列號：NC_000083.6)和斑馬魚(GenBank序列號：NC_007123.7)的一致性分別為95.03%、61.11%和28.90%，可見FSHR基因5′-UTR核苷酸序列在哺乳動物中較為保守。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，在湖羊FSHR基因5′-UTR區(qū)含有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如E-box、CAAT-box和GC-box等(圖2)。采用在線軟件Genomatic對湖羊FSHR基因5′-UTR序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測，結(jié)果顯示，在湖羊FSHR基因5′-UTR序列含有GATA-2、SOX3、IRF-1、Sp1、E4FUSF1和SOX10轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(圖2)。采用在線軟件Methprimer在湖羊FSHR基因5′-UTR中未檢測到CpG島，但發(fā)現(xiàn)多個CpG位點。

*表示轉(zhuǎn)錄起始位點; 黑體字母表示USF1結(jié)合位點；虛線表示起始密碼子* indicate transcription start site. Black letters indicate binding site for USF1;Dashed line indicate start codon圖2 湖羊FSHR基因5′-UTR序列與特塞爾綿羊、牛同源性比對Fig.2 Alignment of FSHR 5′-UTR sequence in Hu sheep with Texel sheep and cattle

2.3 湖羊PAX4基因組織表達(dá)譜分析

PAX4(Paired box 4)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要通過與靶基因調(diào)控區(qū)結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[15]，但關(guān)于其調(diào)控FSHR基因轉(zhuǎn)錄和在卵巢中作用的研究還未見報道。本研究首先以湖羊心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、大腸、小腸、子宮和卵巢11種組織cDNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)檢測各組織中PAX4基因表達(dá)情況，結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，PAX4基因在湖羊11種組織中均有表達(dá)，其中在小腸組織表達(dá)量最高，在心和肝等組織高表達(dá)，在心、肝、肺、胃、腎、子宮和卵巢等組織中等表達(dá)，而在脾、肌肉和大腸等組織中低表達(dá)，可見PAX4是一個卵巢組織表達(dá)基因。

2.4 湖羊PAX4在卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中的作用

本研究合成了湖羊PAX4基因過表達(dá)載體(pcDNA3.1-PAX4)。pcDNA3.1-PAX4載體經(jīng)雙酶切(圖4A)和直接測序鑒定正確后，瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，PAX4過表達(dá)組(即轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PAX4)卵巢顆粒細(xì)胞中PAX4基因mRNA表達(dá)水平極顯著高于對照組(P<0.01)(圖4B)，說明構(gòu)建的湖羊PAX4基因過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-PAX4可在卵巢顆粒細(xì)胞中高效表達(dá)，符合試驗要求。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，PAX4過表達(dá)組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)(圖5)，說明PAX4可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，是一個促凋亡轉(zhuǎn)錄因子。

M.DL100 marker；1～11.心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、大腸、小腸、子宮和卵巢M.DL100 marker; 1-11. Heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, muscle, rectum, intestinal, uterus and ovary圖3 湖羊PAX4基因組織表達(dá)譜Fig.3 The mRNA expression profile of PAX4 gene in various tissues of Hu sheep

A.pcDNA3.1-PAX4載體的酶切鑒定；B. pcDNA3.1-PAX4載體轉(zhuǎn)染后PAX4基因表達(dá)。M.DL5000 marker；1.pcDNA3.1載體；2.pcDNA3.1-PAX4載體。**.P<0.01A.The digested results of pcDNA3.1-PAX4 vector;B.The expression of PAX4 in granulosa cells transfected with pcDNA3.1-PAX4 vector. M.DL5000 marker;1.pcDNA3.1 vector; 2.The restructuring pcDNA3.1-PAX4 vector. **.P<0.01圖4 湖羊PAX4基因過表達(dá)載體在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 The expression of Hu sheep pcDNA3.1-PAX4 vector in ovarian granulosa cells

A、B. 流式細(xì)胞術(shù)檢測pcDNA3.1和pcDNA3.1-PAX4轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞凋亡；C.凋亡率分析。*. P<0.05A，B.Flow cytometry was performed to detect cell apoptosis in GCs transfected with pcDNA3.1 and pcDNA3.1-PAX4;C.Apoptosis rate analysis. *. P<0.05圖5 湖羊PAX4在卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中的作用Fig.5 The role of Hu sheep PAX4 in ovarian granulosa cell apoptosis

2.5 PAX4對湖羊FSHR基因轉(zhuǎn)錄活性的影響

本研究構(gòu)建了包含PAX4結(jié)合位點(CAGGATTG)的湖羊FSHR基因5′-UTR的雙熒光素酶報告載體pGL3-730(圖6A)。將湖羊PAX4基因過表達(dá)載體pcDNA3.1-PAX4與FSHR基因5′-UTR雙熒光素酶報告載體pGL3-730共轉(zhuǎn)體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞，收集細(xì)胞檢測熒光素酶活性，結(jié)果見圖6B。從圖6B中可以看出，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PAX4后，卵巢顆粒細(xì)胞中pGL3-730載體的熒光素酶活性顯著低于對照組(P<0.05)。同樣地，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PAX4后，COS-7細(xì)胞中pGL3-730載體的熒光素酶活性極顯著低于對照組(P<0.01)(圖6C)。結(jié)果說明轉(zhuǎn)錄因子PAX4可下調(diào)湖羊FSHR基因5′-UTR活性，即抑制FSHR基因的轉(zhuǎn)錄活性。

A.pGL3-730載體的酶切鑒定: M.DL2000 marker;1～3.pGL3-730酶切產(chǎn)物。B.過表達(dá)PAX4對卵巢顆粒細(xì)胞中pGL3-730活性的影響;C.過表達(dá)PAX4對COS-7細(xì)胞中pGL3-730活性的影響。*.P<0.05；**.P<0.01A.The digested results of pGL3-730 vector:M.DL2000 marker;1-3.The restructuring pGL3-730 vector.B. Overexpression of PAX4 influences luciferase activity of pGL3-730 vector in granulosa cells; C.Overexpression of PAX4 influences luciferase activity of pGL3-730 vector in COS-7 cells.*.P<0.05;**.P<0.01圖6 PAX4對湖羊FSHR基因轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.6 The effect of PAX4 on the transcriptional activity of FSHR gene in Hu sheep

3 討 論

FSH是促進(jìn)哺乳動物卵巢卵泡生長、發(fā)育、分化和成熟的關(guān)鍵激素，但其生物學(xué)功能的發(fā)揮必須通過與其靶細(xì)胞膜上的受體蛋白(FSHR)結(jié)合才能傳導(dǎo)信號進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)[16]，因此FSHR水平的高低決定了FSH對靶細(xì)胞的作用效果，以及響應(yīng)的生物學(xué)特征[17]。研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究主要在5′調(diào)控區(qū)，其中人、模式動物(如小鼠)和主要家畜(如豬、牛)等哺乳動物FSHR基因5′-UTR和核心啟動子區(qū)均已被成功鑒定，5′調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)和序列特征也進(jìn)行了深入的研究[18-21]。在綿羊中，早在1997年就已鑒定出其FSHR基因的5′-UTR[22]，其核心啟動子區(qū)也于2001年被發(fā)現(xiàn)[23]。另外，國內(nèi)著名地方綿羊品種湖羊FSHR基因核心啟動子區(qū)的鑒定工作也于2014年完成[9]，但目前關(guān)于綿羊特別是湖羊FSHR基因5′-UTR特征的研究相對較少。本研究通過克隆測序獲得了湖羊FSHR基因5′-UTR序列，并發(fā)現(xiàn)其包含多個已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如E-box、CAAT-box和GC-box等。E-box是目前研究最多的FSHR基因5′-UTR 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，在人、大鼠和綿羊等物種中已證實E-box元件可招募大量同源結(jié)合因子、上游刺激因子USF1與USF2，調(diào)控FSHR基因的轉(zhuǎn)錄活性[20]。I.Teino等[24]發(fā)現(xiàn)，AHR可通過E-box元件調(diào)控小鼠卵巢中FSHR基因的轉(zhuǎn)錄活性。另外，CAAT-box可能是RNA聚合酶II(RNA polymerase II，Pol II)特異性結(jié)合的DNA序列元件，控制基因轉(zhuǎn)錄的正確起始和頻率[25-26]，而GC-box一般位于CAAT-box兩側(cè)，是轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合區(qū)域，可激活基因轉(zhuǎn)錄[27-28]，但目前關(guān)于這2個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件調(diào)控FSHR基因轉(zhuǎn)錄的研究還未見報道。湖羊FSHR基因5′-UTR序列中多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究湖羊卵巢組織中FSHR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄因子是一類具有特定功能的蛋白，主要通過與靶基因5′調(diào)控區(qū)上相應(yīng)的結(jié)合位點組合在一起形成順式調(diào)控模塊，共同調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。目前已鑒定的FSHR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子主要包括轉(zhuǎn)錄因子如GATA-1[29]、E2F[29]、GATA-4[30]、GATA-6[30]、AR[31]、DAX-1[31]、OCT-1[32]、FOXL2[33]和YY1[9]等，和表觀遺傳因子如組蛋白去乙?；窶AT2[34]、miR-143[6]和miR-126*[35]等，其中通過作用于5′調(diào)控區(qū)對FSHR基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要還是轉(zhuǎn)錄因子。本研究在湖羊FSHR基因5′-UTR序列中預(yù)測到多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如GATA-2、SOX3、IRF-1、Sp1、E4F、USF1和SOX10等，其中USF1[20]和GATA家族[32]已被證實可調(diào)控哺乳動物FSHR基因轉(zhuǎn)錄。PAX4是已知的促進(jìn)哺乳動物胚胎期內(nèi)分泌腺體發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[15]，但目前關(guān)于其在卵巢中的作用及對FSHR基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究還未見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAX4可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，是一個促凋亡因子，這與FSHR在卵巢顆粒細(xì)胞中的作用正好相反[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PAX4可抑制湖羊FSHR基因轉(zhuǎn)錄活性，這與PAX4、FSHR在卵巢顆粒細(xì)胞中的作用[2]是一致的，說明PAX4是湖羊FSHR基因的功能性轉(zhuǎn)錄因子。

4 結(jié) 論

本研究克隆了湖羊FSHR基因5′-UTR序列，了解了5′-UTR序列特征(如轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)。轉(zhuǎn)錄因子PAX4在湖羊卵巢組織中表達(dá)，可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)，PAX4可抑制湖羊FSHR基因轉(zhuǎn)錄活性，是湖羊FSHR基因的抑制性轉(zhuǎn)錄因子。

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