山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中內參基因的表達穩(wěn)定性分析

許 晴，林 森,，朱江江，王 永,，林亞秋*

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041)

肌內脂肪(Intramuscular fat，IMF)是影響肉質嫩度和風味的重要因素[1]，是肉用畜禽重要經濟性狀之一。IMF沉積受多種因素調控，其中主要是由脂肪細胞數(shù)目的增加和體積的增大造成的。因此，為了闡明山羊肌內脂肪沉積的分子機理，需以體外培養(yǎng)的前體脂肪細胞為研究對象，利用分子生物學和細胞生物學等技術手段來構建其分子調控網絡。為了確保研究的準確性，必須選擇可靠有效的內參基因校正，才能得到真實可靠的目標基因表達變化情況。研究表明，同一內參基因在不同物種[2]、不同細胞[3-4]、同一物種不同組織[5]以及不同試驗處理[6]等條件下其表達穩(wěn)定性不同，所以內參不合適會導致數(shù)據分析時結果出現(xiàn)差異，對有效內參基因的篩選是保證科學研究準確性的重要前提。

目前雖然在反芻動物上關于內參基因篩選的研究報道較多，但尚未見在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中的內參基因的篩選報道，而且已有的報道都多集中于不同組織、不同發(fā)育階段和不同病理狀態(tài)下。比如，陳利等[5]指出，在山羊同一時期不同組織中次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1，HPRT1)表達相對最穩(wěn)定，且最佳內參組合為HPRT1和RNA聚合酶2(RNA polymerase Ⅱ，RP2)，在不同發(fā)育時期的骨骼肌中酪氨酸3-單氧化酶(Tyrosine 3-monooxygenase，YWHAZ)表達相對最穩(wěn)定，其次是β-肌動蛋白(Beta-actin，ACTIN)；Y.Zhang等[7]指出，TATA盒結合蛋白(TATA box-binding protein，TBP)在山羊肝中表達相對穩(wěn)定，而在肌肉中表達較穩(wěn)定基因則為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)；張曉東[8]指出，波爾山羊各個組織相對最優(yōu)內參基因是18S核糖體RNA(18S ribosome RNA，18SrRNA)，為更精確校正試驗數(shù)據可選擇18SrRNA和TBP二者；W.R.Vorachek等[9]發(fā)現(xiàn)，GADPH和YWHAZ是適合患腐蹄病綿羊中性粒細胞相對最好的一對內參基因，但健康綿羊中性粒細胞最穩(wěn)定的內參基因為琥珀酸脫氫酶亞基A(Succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)；而在湖羊小腸黏膜的內參基因篩選試驗中卻表明，被普遍使用的內參基因GAPDH和18S不適合，ACTB和磷酸甘油酸激酶1(Phosphoglycerate kinase 1，PGK1)為該研究的最佳選擇[10]；M. Jedrzejczak等[11]發(fā)現(xiàn)，在牛乳腺上皮細胞中泛表達轉錄子(Ubiquitously expressed transcript，UXT)和GAPDH展現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性；在熱應激和激素處理下，UXT、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase，HPRT)和核糖體蛋白S23(Ribosomal protein S23，RPS23)是牛黑素細胞較穩(wěn)定的內參基因[12]?；谏鲜鰣蟮腊l(fā)現(xiàn)，內參基因穩(wěn)定性具有品種、組織和細胞等特異性，推測山羊肌內前體脂肪細胞的成脂誘導分化具有自己特異穩(wěn)定表達的內參基因。

因此，本研究以簡州大耳山羊體外培養(yǎng)的肌內前體脂肪細胞為研究對象，利用qPCR分別檢測誘導分化0、1、2、3、5和6 d的細胞中GAPDH、肽酰脯氨基順反異構酶A(Peptidylproyl isomerase A，PPIA)、18SrRNA、肽酰脯氨基順反異構酶B(Peptidylproyl isomerase B，PPIB)、UXT、核糖體磷蛋白大亞基P0(Pibosomal protein lateral stalk subunit P0，RPLP0)、ACTB、真核翻譯起始因子3K(Eukaryotic translation initiation factor 3K，EIF3K)和TBP候選內參基因的表達水平[2,7,9,13]，然后分別采用geNorm、NormFinder和 BestKeeper程序進行分析，綜合比較3種程序分析結果，并對Krupple樣轉錄因子3(Krupple-like factor，KLF3)和Krupple樣轉錄因子12(Krupple-like factor，KLF12)的表達水平進行校正分析，進而確定在山羊前體脂肪細胞誘導分化過程中最優(yōu)內參基因及最優(yōu)內參基因組合，為山羊肌內脂肪沉積分子機理的研究提供重要的基礎數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 山羊肌內前體脂肪細胞的獲得及誘導分化 本試驗所用原代肌內脂肪細胞為前期試驗分離和純化[14]，置于液氮中保存?zhèn)溆?。取出低溫保存的原代肌內脂肪細胞，進行細胞復蘇及傳代培養(yǎng)，傳至F3代時加入誘導分化液(100 μmol·L-1油酸)進行誘導分化，并分別在第0、1、2、3、5和6 天收集細胞。

1.1.2 主要試劑 培養(yǎng)基(DMEM/F12)和胰蛋白酶購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Gemini公司；油酸購自Sigma公司；TRIzol和SYBR?Premix ExTaqTM (2×)購自TaKaRa公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA的合成 按照TRIzol試劑盒的使用說明提取F3代山羊肌內脂肪細胞總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA樣品的質量、濃度以及A260 nm/A280 nm值(該值為1.9～2.1的RNA樣品才可用于后續(xù)試驗)。使用Thermo公司反轉錄試劑盒，取以1 μg總RNA為模板進行反轉錄，將獲得的cDNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 熒光定量PCR引物設計及標準曲線構建 本研究選取GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9個基因作為候選內參基因，利用Primer Premier 5.0軟件，根據GenBank上9個基因在山羊中的序列設計熒光定量PCR引物(表1)，引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。將cDNA模板按5倍進行稀釋，選取5-1～5-4稀釋倍數(shù)樣品進行qPCR，借助Excel軟件以樣品濃度的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線，根據E=10(-1/slope)-1計算擴增效率，其中slope為標準曲線斜率。

1.2.3 實時熒光定量PCR qPCR反應總體系為20 μL：cDNA 1 μL，Sense primer(10 μmol·L-1)1 μL，Antisense primer(10 μmol·L-1)1 μL，SYBR?Premix ExTaqTM (2×) PCR 10 μL，補充ddH2O至20 μL。反應在熒光定量聚合酶鏈反應檢測系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)中進行。qPCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，Tm(表1)退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)；65～95 ℃熔解20 s，每0.5 ℃讀取1次熒光。每個時間點肌內脂肪細胞樣品設3個重復，每個樣品進行3次技術重復，陰性對照設置3個無cDNA模板的樣本。

1.2.4 內參基因驗證 分別以KLF3和KLF12作為目標基因，設計并合成特異引物(表1)，利用qPCR技術檢測其在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中的表達量，分別用已篩選出的最穩(wěn)定內參基因組合和2個最不穩(wěn)定內參基因校正KLF3和KLF12的表達，比較在不同內參基因校正時該基因的表達變化情況。反應體系和反應條件同1.2.3。

1.2.5 數(shù)據分析 候選內參基因相對表達量數(shù)據分析，某一候選內參基因各樣本Ct值減去該基因在誘導分化0 d時最小Ct值，得到ΔCt，以2-ΔCt值作為該基因的相對表達量數(shù)值，再利用GraphPad Prism 5軟件繪制候選內參基因相對表達量圖譜；分別采用geNorm[15]、NormFinder[16]和 BestKeeper[17]程序對各內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析；目標基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。geNorm和NormFinder程序導入每個候選內參基因的相對定量數(shù)據，采用2-ΔCt法計算相對定量數(shù)據，其中ΔCt為各樣本Ct值與其對應最小Ct值之差，ΔCt≥0，計算得到各內參基因的平均表達穩(wěn)定度并進行評價，同時利用geNorm程序做配對變異分析Vn/n+1結果圖。BestKeeper程序導入qPCR所獲得的Ct值，根據標準差(SD)和變異系數(shù)(CV)評價內參基因的穩(wěn)定性。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR(qPCR)

S. 正義鏈引物; A. 反義鏈引物
S. Sense primer; A. Antisense primer

2 結 果

2.1 內參基因引物的擴增效率及特異性

對GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9個候選內參基因擴增樣品進行質量檢測，均無引物二聚體，且特異性較好，說明9對引物均能高特異性地擴增目的片段。同時由表2可知，經5倍稀釋梯度所得內參基因標準曲線的線性關系良好，擴增效率為66.5%～111.3%，決定系數(shù)(R2)為0.981 9～0.999 8，表明引物滿足qPCR的擴增條件，得出的結果準確可靠。

2.2 內參基因在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中的相對表達量

利用qPCR檢測GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9個候選內參基因在山羊肌內前體脂肪細胞不同誘導分化時期的相對表達量。結果顯示，9個基因在誘導分化不同時期相對表達量并非恒定，其中UXT、PPIA和PPIB在不同時期相對表達量趨勢基本一致，而18SrRNA和ACTB波動最大(圖1)。

表2 內參基因標準曲線方程、決定系數(shù)R2和擴增效率Table 2 The equation, R-square (R2) of standard curves and amplification efficiency for the reference genes

圖1 候選內參基因在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量Fig.1 The relative expression levels of candidate reference genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes

2.3 候選內參基因在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化不同時期表達的穩(wěn)定性

2.3.1 geNorm程序分析結果 利用geNorm程序計算在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化不同時期候選內參基因的平均表達穩(wěn)定值(M)，M值越小表明內參基因穩(wěn)定性越好。結果，GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP的M值依次為0.730、0.619、1.149、0.534、0.530、0.626、0.803、0.731和0.637，其中18SrRNA的表達水平變化相對最劇烈。依次去除最不穩(wěn)定基因后結果顯示，UXT和PPIB表達最穩(wěn)定(圖2)，且M=0.240 2。內參基因的配對差異值Vn/n+1分析結果顯示(圖3)，V2/3<0.15，說明在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中，使用2個內參基因(UXT和PPIB)即可達到準確校正目標基因表達的目的，無需引入更多內參基因。

圖3 利用geNorm程序分析候選內參基因的配對變異系數(shù)Fig.3 The pairwise variations of candidate reference genes by geNorm program

2.3.2 NormFinder程序分析結果 利用NormFinder程序對GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9個候選內參基因穩(wěn)定值(S)進行計算及分析，結果指出(表3)，與其他候選內參及因相比UXT基因具有最小的S值(S=0.109)，表明該基因在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化不同時期表達相對最穩(wěn)定，其次表達較穩(wěn)定的基因為PPIB和RPLP0，18SrRNA表達最不穩(wěn)定(S=0.505)。同時NormFinder程序提供兩個內參基因同時使用的最佳組合為UXT和PPIB基因，穩(wěn)定值為0.106。

2.3.3 BestKeeper程序分析結果 利用BestKeeper程序分析獲得各基因相關系數(shù)、標準差和變異系數(shù)(表4)，根據前人判定原則[18]可知，9個候選內參基因中，PPIB基因表達最穩(wěn)定，其次為UXT和PPIA，18SrRNA表達最不穩(wěn)定。由表5可知，GAPDH與ACTB和PPIB與UXT的相關系數(shù)最大，根據GAPDH、ACTB、PPIB和UXT基因各自的穩(wěn)定性，最終確定同時使用兩個內參基因的最佳組合為PPIB和UXT。

表3 利用NormFinder程序分析候選內參基因的穩(wěn)定值Table 3 The stability values of candidate reference genes by NormFinder program

2.4 山羊肌內脂肪細胞誘導分化過程中內參基因表達的綜合分析

為綜合3個程序的分析結果，對誘導分化不同時間段的候選內參基因穩(wěn)定性等級進行了平均值計算，9個候選內參基因GAPDH、ACTB、EIF3K、PPIA、PPIB、UXT、TBP、RPLP0和18SrRNA的穩(wěn)定性等級排序的平均等級為6.0、6.3、7.3、3.6、1.7、1.3、4.6、5.0和9.0(表6)。由此可見，在誘導分化過程中UXT基因的表達穩(wěn)定性相對最好，其次為PPIB基因，而18SrRNA表達水平最不穩(wěn)定。綜合考慮3個程序對基因穩(wěn)定性及配對分析可得，UXT和PPIB為最佳內參組合以校正目標基因表達量。

表4 利用BestKeeper程序分析候選內參基因的表達穩(wěn)定性Table 4 The expression stability of candidate reference genes by BestKeeper program

表5 利用BestKeeper程序分析候選內參基因間的相關系數(shù)Table 5 The correlation coefficients among candidate reference genes by BestKeeper program

2.5 山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中內參基因的表達驗證

為了進一步探索應用最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定內參基因進行校正時是否存在差異，分別以UXT和PPIB的幾何平均數(shù)、UXT、EIF3K和18SrRNA為內參基因，分析LKF3和KLF12在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中的表達情況。結果顯示(圖4)，在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中，以UXT和PPIB的幾何平均數(shù)和UXT為校正因子時，KLF3的表達模式相同，均呈降低(0～3 d)后升高(5 d)再降低(6 d)的趨勢；以EIF3K為校正因子時，大致趨勢與前者相同，但在2和3 d時表達量下調(分別下調0.76和0.70倍)；而以18SrRNA為校正因子時，KLF3的表達量呈逐漸下降趨勢。KLF12出現(xiàn)相同變化，以UXT和PPIB的幾何平均數(shù)、UXT和EIF3K為校正因子時表達模式相同，但EIF3K校正時KLF12表達量下調，而18SrRNA為校正因子時KLF12表達模式發(fā)生變化，峰值出現(xiàn)在分化1 d的肌內脂肪細胞(上調1.34倍)。

表6 利用3種程序分析候選內參基因的穩(wěn)定性等級排序Table 6 Overall stability ranks of candidate reference genes by 3 programs

A和C表示分別以UXT&PPIB、18S rRNA和EIF3K為內參基因時，KLF3和KLF12在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中的相對表達水平；B和D表示分別以UXT&PPIB和UXT為內參基因時，KLF3和KLF12在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中的相對表達水平A and C represent the expression levels of KLF3 and KLF12 genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes when UXT&PPIB, 18S rRNA and EIF3K were used as reference genes; B and D represent the expression levels of KLF3 and KLF12 genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes when UXT&PPIB and UXT were used as reference genes圖4 不同內參基因校正下KLF3和KLF12在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中的表達水平Fig.4 The expression levels of KLF3 and KLF12 genes normalized by different reference genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes

3 討 論

qPCR技術是檢測基因表達水平最常用的手段，而內參基因的選擇直接影響了其結果的準確性。但大量的研究證明，這些內參基因是在特定條件下穩(wěn)定表達，內參基因的盲目選擇會導致定量結果不真實[19]。例如在蛋雞不同組織中核糖體蛋白S2(Ribosomal protein S2，RPS2)和ACTB基因表達相對更穩(wěn)定[20]；而TBP、核糖體蛋白L4(Ribosomal protein L4，RPL4)基因則是在豬肌肉組織中相對穩(wěn)定表達的內參基因[21]；李迪等[22]在校正鱖魚qPCR結果時發(fā)現(xiàn)，β-2-微球蛋白(Beta-2 microglobulin，B2M)和核糖體蛋白L13a(Ribosomal protein L13a，RPL13a)表達相對最穩(wěn)定；在關于綿羊的研究中發(fā)現(xiàn)，GAPDH、SDHA和ACTB適合于大腦、G6PDH、ACTB和YWHAZ適合于小腦，而SDHA、核糖體蛋白L19(Ribosomal protein L19，RPL19)和GAPDH適合于腸系膜淋巴結中校正目標基因表達[23]。因此具有針對性的篩選內參基因具有重要意義。本試驗利用qPCR技術檢測山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中內參基因的相對表達發(fā)現(xiàn)(圖1)，UXT、PPIB和PPIA表達相對穩(wěn)定，18SrRNA和ACTB變化最大。因此為了進一步確定最優(yōu)內參基因，本研究分別利用geNorm、NormFinder和 BestKeeper程序對9個候選內參基因穩(wěn)定性進行分析。

研究者多用geNorm、NormFinder和 BestKeeper等程序來專門評價內參基因的穩(wěn)定性。J. Vandesompele 等[15]于2002年編寫了geNorm程序，該程序可用于任何試驗條件下篩選最適內參基因，并選出最優(yōu)內參基因組合以校正目標基因表達。geNorm程序根據各內參基因相對表達量計算穩(wěn)定值M以及配對變異Vn/n+1值，M值越小則內參基因表達越穩(wěn)定，Vn/n+1值小于0.15時最適內參基因個數(shù)為n，反之則為n+1。C.L.Andersen等[16]于2004年編寫了NormFinder程序，運行該程序所得穩(wěn)定值S是通過計算各內參基因相對表達量而獲得，該值越小內參基因穩(wěn)定性越好；同年M.W.Pfaffl等[17]編寫了BestKeeper程序，該程序不僅可以分析內參基因的表達穩(wěn)定性，而且還可以對目標基因表達量進行分析，輸入qPCR原始數(shù)據，運行得到內參基因間相關系數(shù)、變異系數(shù)和標準差。本研究結果經分析發(fā)現(xiàn)，3種程序分析結果并不相同，geNorm和NormFinder程序分析顯示UXT表達相對最穩(wěn)定，而BestKeeper程序分析發(fā)現(xiàn)PPIB表達更穩(wěn)定，3個程序分析結果均表明，使用UXT和PPIB基因即可準確校正在山羊肌內前體脂肪細胞分化不同時期目標基因的表達水平；且在本試驗條件下最不穩(wěn)定的內參基因均為18SrRNA。

為了最終確定適合于山羊肌內前體脂肪細胞成脂誘導分化的最適內參基因，本試驗綜合分析了9個候選基因的穩(wěn)定等級排名發(fā)現(xiàn)，在山羊肌內前體脂肪細胞分化不同時期UXT基因表達水平相對最穩(wěn)定，最不穩(wěn)定基因為18SrRNA，并且應用UXT和PPIB組合作為內參基因校正目標基因表達更準確。UXT是PFD(α-class prefoldin)蛋白家族成員之一[24]，是在動物研究中受不同物種、組織、試驗環(huán)境影響差異較小的內參基因之一。M. Bonnet等[2]研究發(fā)現(xiàn)，UXT基因在牛和山羊的乳腺、肝和脂肪組織中表達相對最穩(wěn)定。UXT基因表達的穩(wěn)定性不受日糧[25]和泌乳周期[26]影響，適合作為圍產期、泌乳期奶牛乳腺組織的內參基因。在關于牦牛乳體細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S9(Ribosomal protein S9，RPS9)、蛋白磷酸酶1調控亞基11(Protein phosphatase 1 regulatory subunit 11，PPP1R11)、UXT和線粒體核糖體蛋白L39(Mitochondrial ribosomal protein L39，MRPL39)為穩(wěn)定表達的內參基因[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，UXT是山羊肌內前體脂肪細胞分化不同時期表達相對最穩(wěn)定的基因，為UXT基因作為一種較為普遍使用的內參基因提供了佐證，但也有研究提出，UXT并不適合作為荷斯坦奶牛乳體細胞的內參基因[27]，所以每一物種不同細胞或者組織內穩(wěn)定表達的內參基因都需要通過試驗來進行驗證。PPIB是肽酰脯氨基順反異構酶(Peptidylproyl isomerase，PPI)家族的成員，與PPIA高度同源，在體內分布廣泛，與自身免疫性疾病密切相關[28-29]。PPIB基因與ACTB和GAPDH相比，更適合作為人外周血液的內參基因[30]。本團隊的前期研究發(fā)現(xiàn)，PPIB和羥甲基膽素合酶(Hydroxymethyl-bilane synthase，HMBS)是成都麻羊和簡州大耳山羊不同部位肌肉組織中相對最穩(wěn)定的內參基因[18]。這些研究結果為其他物種、細胞及試驗條件下以PPIB作為候選內參基因提供了參考。

為了確定本試驗篩選得到的適合研究山羊肌內前體脂肪細胞分化過程的內參基因及組合，需要以特定的目標基因來進行驗證。KLF3和KLF12是KLF轉錄因子家族成員，轉錄調控是脂肪細胞分化的最重要調控方式，本實驗室前期轉錄組測序數(shù)據表明，KLF3和KLF12可能參與山羊肌內前體脂肪細胞分化過程，因此本試驗選擇二者作為目標基因來驗證所篩選內參基因的準確性。結果表明，將UXT和PPIB的幾何平均數(shù)、UXT和EIF3K基因用于歸一化分析時，KLF3和KLF12的表達模式未發(fā)生變化，相對于UXT和PPIB而言EIF3K作為內參時目標基因的表達量降低。以18SrRNA作為內參基因，KLF3和KLF12的表達模式均發(fā)生變化。因此，當選用不同內參基因進行歸一化分析時，KLF3和KLF12的表達模式有很大差異，說明需要準確的篩選內參基因以得到正確的目標基因的表達變化，并不能盲目的選用常用內參基因18SrRNA進行分析。近年來也有一些研究報道了18SrRNA在一些物種、組織和試驗條件下不適合作為內參基因。比如W.Z.Zhu等[18]發(fā)現(xiàn)，18SrRNA是山羊背最長肌和股二頭肌表達最不穩(wěn)定的內參基因；此外，18SrRNA在山羊小腸組織中也不能穩(wěn)定表達[7]，在山羊不同日齡及不同部位的小腸黏膜中的表達同樣不穩(wěn)定[10]。在關于新西蘭白兔[31]等內參篩選中也得到了相似的結果。因此，本研究結果表明，UXT和PPIB組合為最適合研究山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程的內參基因，這為后續(xù)闡明山羊IMF沉積分子機理數(shù)據的準確性提供了重要的基礎。

4 結 論

本研究成功篩選出山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化不同時期的內參基因，最佳選擇為UXT，而18SrRNA穩(wěn)定性相對較差，不適合作為相關研究的內參基因。同時使用2個內參對目標基因進行校正的最適內參組合為UXT和PPIB，該研究結果為檢測山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中目標基因的表達提供了內參依據。

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