TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾與蘇太斷奶仔豬E. coli F18抗性的關(guān)系

戴超輝，馮海悅，宗秋芳，吳圣龍,2，包文斌,2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省種豬繁育和健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，揚(yáng)州 225009)

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是機(jī)體對(duì)病原體侵襲產(chǎn)生先天性免疫應(yīng)答信號(hào)通路的一類受體，在宿主免疫反應(yīng)及炎癥過程中起重要作用[1-2]。TLR5屬于TLRs家族成員，具有模式識(shí)別受體的功能，同時(shí)它也是機(jī)體識(shí)別革蘭氏陰性菌鞭毛蛋白的受體，可以介導(dǎo)機(jī)體針對(duì)病原菌的先天性免疫及炎癥反應(yīng)[3-5]。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.genome.jp/kegg/pathway.html)顯示，TLR5主要參與了髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88, MyD88)介導(dǎo)的Toll-like信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)以及炎癥性腸病信號(hào)通路(Inflammatory bowel disease, IBD)、致病性大腸桿菌感染信號(hào)通路(PathogenicEscherichiacoliinfection)、沙門氏菌感染信號(hào)通路(Salmonellainfection)和軍團(tuán)菌病信號(hào)通路(Legionellosis)。豬的TLR5基因全長(zhǎng)22 359 bp，開放閱讀區(qū)(ORF)長(zhǎng)2 571 bp，編碼的蛋白包括胞外區(qū)(LRR結(jié)構(gòu)域)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(TIR結(jié)構(gòu)域)，具有典型的TLR家族結(jié)構(gòu)特征[6]。豬TLR5分子在腎、肝、肺、小腸、脾和胸腺等組織均有表達(dá)[6]，并且具有較好的免疫反應(yīng)性[7]。有研究表明，豬TLR5分子可識(shí)別豬霍亂沙門氏菌等細(xì)菌的鞭毛蛋白[8-9]，并且TLR5基因的特異單倍型與豬丹毒抗體免疫應(yīng)答有關(guān)[10]。M.A.Dominguez等[11]通過掃描豬TLR5基因的啟動(dòng)子序列，鑒定了啟動(dòng)子序列中7個(gè)單核苷酸多態(tài)性和兩個(gè)Indel變異，其中一個(gè)Indel由在-581～-559處核苷酸位置的23 bp插入組成，產(chǎn)生另外的STAT結(jié)合位點(diǎn)，從而調(diào)控TLR5的表達(dá)。本課題組前期對(duì)中國(guó)地方豬品種梅山豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型斷奶仔豬十二指腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選并初步確定TLRs信號(hào)通路可對(duì)斷奶仔豬大腸桿菌抗性具有重要調(diào)控作用[12]。上述研究表明，豬TLR5基因在針對(duì)外源抗原的固有免疫應(yīng)答中確實(shí)發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。同時(shí)其作為Toll-like家族一員不僅本身在菌毛蛋白識(shí)別中具有重要作用，而且在斷奶仔豬大腸桿菌抗性調(diào)控中也發(fā)揮重要功能。

在真核生物中，DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式，它通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、DNA的構(gòu)象、染色體的穩(wěn)定性以及DNA和蛋白質(zhì)的相互作用而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，最終影響生物學(xué)功能[13]。已有研究表明，DNA甲基化在植物抗逆性以及動(dòng)物的抗病性等方面發(fā)揮了重要作用[14-16]。鑒于豬TLR5基因重要的生物學(xué)功能，本研究利用生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)確定TLR5基因核心啟動(dòng)子區(qū)、CpG島及其作用元件，進(jìn)而分析TLR5基因核心啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾與斷奶仔豬對(duì)F18大腸桿菌抗性的關(guān)系，以期為揭示TLR5基因調(diào)控?cái)嗄套胸i大腸桿菌抗性的分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)豬來自于課題組前期建立的蘇太豬F18大腸桿菌病抗性型和敏感型資源群體，在3個(gè)蘇太豬抗性型和敏感型資源家系中根據(jù)課題組建立的V型分泌系統(tǒng)展呈功能性黏附素和受體結(jié)合試驗(yàn)技術(shù)[17]，篩選出確證的抗性型和敏感型個(gè)體各3頭(在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，初生重、斷奶重、體形和毛色等性狀基本一致)。在仔豬斷奶前后，也是最易感染E.coliF18而表現(xiàn)出腹瀉癥狀的35日齡階段，屠宰后采集十二指腸和空腸組織樣，現(xiàn)場(chǎng)液氮保存，然后轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試驗(yàn)試劑

胎牛血清FBS、培養(yǎng)液DMEM/F12(DF)、胰酶Trypsin-EDTA Solution、細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板均購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))；RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司(中國(guó)，南京)；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱源科技發(fā)展有限公司(中國(guó)南京)；兔源一抗TLR5(1∶400)和β-actin(1∶4 000)購(gòu)自Abcam(Cambridge，UK)；抗兔二抗(IgG-HRP，1∶3 000)購(gòu)自Jackson(PA，USA)。豬小腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)惠贈(zèng)；BW23473感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自成都傳世科為生物技術(shù)有限公司；pCpGL-basic載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)友情提供；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒和PyroMark系列試劑盒均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；切膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司(北京，中國(guó))。

1.3 引物設(shè)計(jì)及序列合成

根據(jù)TLR5基因編碼序列(GenBank登錄號(hào)：AB208697.2)設(shè)計(jì)TLR5基因qPCR引物，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行均一化。同時(shí)設(shè)計(jì)TLR5基因編碼序列和啟動(dòng)子區(qū)的PCR擴(kuò)增引物，確定核心啟動(dòng)子區(qū)的截短型引物以及進(jìn)行甲基化檢測(cè)的BSP引物。引物的具體信息見表1，所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增序列引物信息Table 1 The primer information of amplification sequences

qPCR代表定量引物，P1～P7分別代表啟動(dòng)子區(qū)不同區(qū)段的擴(kuò)增引物，B1和B2分別代表用于啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)的BSP引物；P1～P7中上下游引物斜體字母分別代表限制性內(nèi)切酶SpeⅠ與NcoⅠ的酶切位點(diǎn)
qPCR represents quantitative primer; P1-P7 represent amplification primers with different regions of the promoter region, respectively; B1 and B2 represent BSP primers for promoter methylation detection, respectively;Italic letters in the upstream and downstream primers of P1-P7 represent the restriction enzymes digestion sites ofSpeⅠ andNcoⅠ

1.4 TLR5在蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型小腸組織中的表達(dá)差異檢測(cè)

1.4.1 組織總RNA的提取及cDNA合成 嚴(yán)格按照說明書，使用Trizol試劑提取F18大腸桿菌抗性型和敏感型蘇太斷奶仔豬十二指腸和空腸組織的總RNA。并以1%甲醛變性凝膠電泳和NanoDrop-1000微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的純度和濃度，-70 ℃保存待用。以RNA為模板進(jìn)行cDNA合成：10 μL的反應(yīng)體系中含5×qRT SuperMix Ⅱ 2 μL，總RNA 500 ng，RNase free ddH2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 2.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，2 × SYBR Premix ExTapTM II 10 μL，50 × ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，RNase free ddH2O補(bǔ)至20 μL，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；為了分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，在PCR擴(kuò)增結(jié)束后采集多個(gè)信息點(diǎn)，進(jìn)行熔解曲線的分析，具體程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。利用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[18]。

1.4.3 Western blot分析 嚴(yán)格按照說明書，使用總蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，使用BCA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)水平，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺電泳)條件：10 μL蛋白樣品液上樣至10%濃度凝膠， 120 V電壓電泳90 min。Blotting(蛋白印記)：蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(聚丙烯二氟乙烯膜)，與相關(guān)抗體進(jìn)行免疫印跡，按約0.1 m·cm-2的量加入封閉液和適量一抗TLR5(1∶400)和β-actin抗體(1∶4 000)。HRP抗體作為二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記抗體，二抗用封閉液1∶3 000稀釋)，β-actin蛋白作為參照。

1.5 TLR5啟動(dòng)子區(qū)確定和作用元件分析

首先根據(jù)TLR5基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NC_010452.4)截取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp序列作為模板，通過設(shè)計(jì)截短型引物(表1)在3′末端對(duì)序列進(jìn)行截短以擴(kuò)增不同區(qū)段的啟動(dòng)子片段。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，條帶正確的送測(cè)序驗(yàn)證。對(duì)確證的6對(duì)不同引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，然后和pCpGL-basic載體進(jìn)行雙酶切(SpeⅠ與NcoⅠ)。酶切體系：PCR產(chǎn)物/載體1.0 μg，10×Cutsmart buffer 5.0 μL，SpeⅠ 1.0 μL，NcoⅠ 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。37 ℃酶切4 h，利用PCR回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，通過T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)條件為16 ℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BW23473，用無抗生素的低鹽LB培養(yǎng)液220 r·min-1復(fù)蘇培養(yǎng)1 h，涂布含博來霉素的抗性平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆搖菌5 h，進(jìn)行菌液PCR，將電泳條帶正確的菌液進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序載體上游引物5′→3′F：CTCTTTGTTCAGCTCTCTGTTT。下游引物為相應(yīng)PCR擴(kuò)增的下游引物，對(duì)確證的重組菌液進(jìn)行純化培養(yǎng)和質(zhì)粒抽提，分別命名為-2 000 bp-pCpGL、-1 500 bp-pCpGL、-1 000 bp-pCpGL、-750 bp-pCpGL、-500 bp-pCpGL、-250 bp-pCpGL和-100 bp-pCpGL。

IPEC-J2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DF培養(yǎng)液培養(yǎng)在12孔板中，培養(yǎng)條件為含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，待生長(zhǎng)至80%密度，將7種重組載體分別和海腎熒光素酶TLK載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。對(duì)雙熒光素酶活性有顯著差異的區(qū)段，通過BDGP軟件(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù)測(cè)TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)的核心啟動(dòng)子區(qū)，利用Alibaba2軟件(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)對(duì)豬TLR5基因核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域的分析。

1.6 TLR5啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化和mRNA相關(guān)性分析

利用MethPrimer軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預(yù)測(cè)分析豬TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島，預(yù)測(cè)總片段為1 000 bp，預(yù)測(cè)參數(shù)設(shè)定：CpG島指序列長(zhǎng)度至少100 bp，GC含量大于50%，CpGo/e大于0.6。為了檢測(cè)TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平及其與mRNA表達(dá)相關(guān)性，以蘇太抗性型和敏感型個(gè)體空腸組織DNA為試驗(yàn)材料，先利用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒對(duì)基因組進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，然后利用MethPrimer軟件，基于原序列經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的序列，設(shè)計(jì)PCR引物，利用PyroMark PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總體系為25 μL：PyroMark PCR Master Mix 2 × 12.5 μL，CoraLoad Concentrate 10 × 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 2 μL，Q-solution 5 × 5 μL，Primer F/R 各0.5 μL，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA液2 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 15 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共循環(huán)45次；最后72 ℃ 10 min。用1%的瓊脂糖凝膠鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后用切膠回收試劑盒回收目的片段，純化后與T載體連接、轉(zhuǎn)化，每個(gè)樣本挑取20個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送上海生工生物有限公司測(cè)序。將經(jīng)甲基化引物擴(kuò)增的序列和原始DNA序列以及轉(zhuǎn)化序列比對(duì)，找出發(fā)生甲基化的CG位點(diǎn)。分別以單個(gè)位點(diǎn)甲基化程度與mRNA表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，利用GraphPad Prism 6繪制關(guān)聯(lián)圖譜。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 TLR5在蘇太仔豬不同E.coli F18抗性個(gè)體小腸組織中的表達(dá)差異分析

利用qPCR檢測(cè)了TLR5基因在蘇太斷奶仔豬抗性組與敏感組腸道組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，十二指腸中敏感組個(gè)體TLR5基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于抗性組(P<0.05)，在空腸組織中敏感組極顯著高于抗性組(P<0.01)(圖1A)；Western blot結(jié)果表明，敏感組中的TLR5蛋白表達(dá)水平也明顯高于抗性組(圖1B)，通過Image J對(duì)蛋白條帶灰度面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以TLR5蛋白與內(nèi)參β-actin的比值作為灰度值，并把抗性個(gè)體灰度值的平均值定義為單位1，對(duì)蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析，發(fā)現(xiàn)十二指腸和空腸中敏感組個(gè)體TLR5基因的蛋白表達(dá)水平均顯著高于抗性組(P<0.05)(圖1C)。

A. mRNA表達(dá)水平；B. 蛋白免疫印跡；C. 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。*. P<0.05，**. P<0.01，下同A.The mRNA expression level; B.Western blot; C. The relative protein expression. *. P<0.05, **. P<0.01, the same as below圖1 蘇太豬腸道組織中TLR5基因(蛋白)在抗性組和敏感組中的表達(dá)Fig.1 The expression of TLR5 gene (protein) in intestinal tissues of E. coli F18-resistant and sensitive Sutai piglets

2.2 蘇太豬TLR5啟動(dòng)子區(qū)CpG島和作用元件分析

本研究首先結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件確定TLR5基因的啟動(dòng)子區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)CpG島以及作用元件。啟動(dòng)子擴(kuò)增和甲基化擴(kuò)增結(jié)果見圖2，啟動(dòng)子區(qū)所有截短型引物均擴(kuò)增正確，重組載體酶切正確，2個(gè)CpG區(qū)段擴(kuò)增正確。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果見圖3，啟動(dòng)子-2 000 bp區(qū)段啟動(dòng)子活性極顯著高于對(duì)照組，且-1 000 bp處活性增加，但差異不顯著；而-500～-250 bp和-250～-100 bp處，啟動(dòng)子活性顯著降低，說明-500～-250 bp和-250～-100 bp區(qū)域內(nèi)均存在調(diào)控元件，對(duì)轉(zhuǎn)錄影響很大，因此重點(diǎn)關(guān)注-1 000 bp區(qū)段的啟動(dòng)子區(qū)域。在線軟件預(yù)測(cè)了3段TLR5基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游13～62 bp、上游255～304 bp和上游864～913 bp，包含2個(gè)CpG島，16個(gè)作用元件(圖4)。

A. 截短型引物擴(kuò)增的結(jié)果；B. 重組質(zhì)粒酶切結(jié)果；C. 甲基化引物擴(kuò)增結(jié)果，其中1～3代表CpG1，4～6代表CpG2。M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A.The amplification result of promoter fragments; B. The digestion result of recombinant plasmid; C.Amplification results of methylation primers, in which 1-3 represent amplification of CpG1, 4-6 represent amplification of CpG2. M. DL2000 marker圖2 啟動(dòng)子和甲基化擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of promoter and methylation sequences

以螢火蟲熒光素酶Rn活性/海腎素?zé)晒馑孛?Ff活性的值作為熒光素酶活性。其中橫坐標(biāo)代表啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶活性相對(duì)于對(duì)照質(zhì)粒Basic-pCpGL的差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表不同截短的區(qū)段對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)The luciferase activity was calculated as the ratio of the activity of firefly luciferase (Rn)/the activity of perineurin luciferase (Ff). The abscissa represents fold change in the luciferase activity of the promoter region compared to the control plasmid Basic-pCpGL. The ordinate represents the plasmids corresponding to the different truncated segments. Different capital letters indicate very significant differences (P<0.01)圖3 TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)不同區(qū)段雙熒光素酶活性檢測(cè)Fig.3 Detection of dual luciferase activity in different regions of TLR5 gene promoter region

A. 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 000 bp處的CpG島預(yù)測(cè)；B. 基于BDGP軟件的核心啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)；C. 啟動(dòng)子區(qū)作用元件分析，其中帶框堿基代表核心啟動(dòng)子區(qū)，加粗堿基代表CpG島，下劃線代表作用元件結(jié)合位點(diǎn)A. CpG island prediction at 1 000 bp upstream of the transcription start site; B.Prediction of the core promoter region based on BDGP software; C. The analysis of acting elements in promoter region, in which the bases with box represent the core promoter region, bold bases represent CpG island sequences and the underlined bases represent the binding sites of acting elements圖4 TLR5基因核心啟動(dòng)子區(qū)和CpG島預(yù)測(cè)以及作用元件分析Fig.4 Prediction of TLR5 gene core promoter region and CpG island and analysis of acting elements

2.3 蘇太豬TLR5啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化和mRNA相關(guān)性分析

在確定TLR5基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域和作用元件后，通過對(duì)圖4C所在的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化分析發(fā)現(xiàn)，CpG1共有6個(gè)CG位點(diǎn)，但是發(fā)生甲基化的位點(diǎn)只有3個(gè)，并且各位點(diǎn)的甲基化與mRNA表達(dá)量并無顯著相關(guān)；CpG2總共有15個(gè)CG位點(diǎn)，各位點(diǎn)均發(fā)生了不同程度的甲基化，并且第6個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化與mRNA表達(dá)有顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖5和圖6)，且該位點(diǎn)位于核心啟動(dòng)子區(qū)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上。

3 討 論

研究表明，Toll樣受體TLRs家族能夠識(shí)別保守的微生物結(jié)構(gòu)(如細(xì)菌脂多糖)并激活信號(hào)通路，從而導(dǎo)致由微生物感染引起的免疫應(yīng)答[19]。TLRs能夠感應(yīng)腸道中的微生物群體，并啟動(dòng)促炎信號(hào)通路來抵抗微生物病原體的入侵[20]。與人源類似，豬源TLRs信號(hào)通路也主要分為4種：MyD88依賴通路、TICAM1依賴通路、小GTP酶通路和磷脂酰肌醇(PIPs)通路[21-24]。所有的TLRs均包含TIR結(jié)構(gòu)域，MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域都可與之結(jié)合；MyD88依賴通路是除TLR3外所有TLRs的共同通路，因此TLR5信號(hào)通路屬于MyD88依賴通路，它可以最終激活核因子-κB(Nuclear factor-κB, NF-κB)，導(dǎo)致許多目的基因表達(dá)上調(diào)[25]。本課題組前期對(duì)中國(guó)地方豬品種梅山斷奶仔豬E.coliF18抗性型和敏感型全同胞個(gè)體十二指腸組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并最終篩選出重要的免疫通路——TLRs信號(hào)通路可能與斷奶仔豬大腸桿菌抗性有關(guān)[12]。在本研究中，我們檢測(cè)了蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個(gè)體小腸組織中TLR5基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TLR5基因在蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型十二指腸組織中的表達(dá)顯著低于在敏感型中的表達(dá)(P<0.05)，其在抗性型空腸組織中的表達(dá)極顯著低于在敏感型中的表達(dá)(P<0.01)，說明TLR5基因的表達(dá)水平確實(shí)和大腸桿菌的抗性有關(guān)，并且進(jìn)一步推斷其低表達(dá)可能有利于斷奶仔豬抵抗大腸桿菌侵染。本試驗(yàn)結(jié)果與TLR5作為細(xì)菌受體的生物學(xué)功能是一致的，其作為Toll-like家族一員不僅本身在菌毛蛋白識(shí)別中具有重要作用，并且在斷奶仔豬大腸桿菌抗性調(diào)控中也發(fā)揮著重要功能。至于TLR5基因的表達(dá)是通過什么途徑來調(diào)控大腸桿菌抗性的，有必要對(duì)TLR5基因調(diào)控大腸桿菌的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖5 TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度分析Fig.5 The methylation analysis of CpG islands in TLR5 gene promoter region

圖6 TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度與mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.6 The correlation analysis between methylation degree of CpG islands in TLR5 gene promoter region and mRNA expression

基因表達(dá)調(diào)控的方式有很多種，其中啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化是調(diào)節(jié)基因功能的重要手段。Z.Z.Xiao等[26]對(duì)豬LYN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及基因表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，甲基化對(duì)豬LYN基因的轉(zhuǎn)錄起著重要作用。L.Sun等[27]證實(shí)了豬BPI啟動(dòng)子區(qū)mC-15位點(diǎn)的甲基化可以抑制C/EBPβ與啟動(dòng)子結(jié)合的能力，并影響其表達(dá)。因此，我們對(duì)TLR5基因啟動(dòng)子開展了一系列研究。我們首先根據(jù)雙熒光素酶活性檢測(cè)和軟件預(yù)測(cè)了TLR5基因的核心啟動(dòng)子區(qū)和CpG島，利用BSP克隆測(cè)序分析了啟動(dòng)子區(qū)的2個(gè)CpG島各位點(diǎn)的甲基化程度，并與mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)第2個(gè)CpG島第6個(gè)CG位點(diǎn)甲基化水平對(duì)TLR5基因的表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。而這個(gè)CG位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合域，因此我們推測(cè)TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)第2個(gè)CpG島第6個(gè)CG位點(diǎn)甲基化阻礙了轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合，從而抑制TLR5基因的表達(dá)，并最終影響大腸桿菌的抗性。本研究結(jié)果表明，TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)存在調(diào)控TLR5基因表達(dá)的CpG島(第2個(gè)CpG島)，其中存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(SP1)結(jié)合的重要CG位點(diǎn)(mC-6)。我們推測(cè)，當(dāng)仔豬受到F18大腸桿菌侵襲時(shí)，TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)第2個(gè)CpG島第6個(gè)CG位點(diǎn)發(fā)生甲基化阻礙了轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合，進(jìn)而抑制TLR5基因的表達(dá)，并最終表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌的抗性。下一步將在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證TLR5基因的調(diào)控功能，并結(jié)合免疫共沉淀或凝膠遷移試驗(yàn)等技術(shù)深入研究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)核心啟動(dòng)子的調(diào)控作用，以期為TLR5基因的表觀遺傳修飾作用提供更完整的試驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究首先通過組織和蛋白表達(dá)水平初步確定TLR5表達(dá)與大腸桿菌抗性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)豬TLR5基因的表達(dá)水平確實(shí)和F18大腸桿菌的抗性有關(guān)，其低表達(dá)可能有利于F18大腸桿菌抗性。然后通過啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化分析，預(yù)測(cè)并確定了TLR5核心啟動(dòng)子區(qū)和甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)第2個(gè)CpG島第6個(gè)CG位點(diǎn)甲基化水平和TLR5基因的表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)。由此推測(cè)TLR5基因啟動(dòng)子區(qū)第2個(gè)CpG島第6個(gè)CG位點(diǎn)甲基化能夠顯著抑制TLR5基因的表達(dá)，并最終影響斷奶仔豬對(duì)大腸桿菌的抗性。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] DE NARDO D.Toll-like receptors:Activation,signalling and transcriptional modulation[J].Cytokine,2015,74(2):181-189.

[2] KANURI G,LADURNER R,SKIBOVSKAYA J,et al.Expression of toll-like receptors 1-5 but not TLR 6-10 is elevated in livers of patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].LiverInt,2015,35(2):562-568.

[3] KRAVCHENKO V V,KAUFMANN G F.Bacterial inhibition of inflammatory responses via TLR-independent mechanisms[J].CellMicrobiol,2013,15(4):527-536.

[4] MILLER A H,VAYTTADEN S J,AL-KHODOR S,et al.Assay development for image-based quantification of intracellular bacterial replication and analysis of the innate immune response to infection[J].AssayDrugDevTechnol,2015,13(9):515-528.

[5] ADIB-CONQUY M,SCOTT-ALGARA D,CAVAILLON J M,et al.TLR-mediated activation of NK cells and their role in bacterial/viral immune responses in mammals[J].ImmunolCellBiol,2014,92(3):256-262.

[6] SHINKAI H,TANAKA M,MOROZUMI T,et al.Biased distribution of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in porcine Toll-like receptor 1 (TLR1),TLR2,TLR4,TLR5,and TLR6 genes[J].Immunogenetics,2006,58(4):324-330.

[7] 孫小林,潘志明,方 強(qiáng),等.我國(guó)地方品種姜曲海豬TLR5基因的克隆、表達(dá)及鑒定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(4):436-438.

SUN X L,PAN Z M,FANG Q,et al.Cloning,expression and identification ofTLR5 gene from native Chinese variety Jiangquhai pigs[J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology,2012,28(4):436-438.(in Chinese)

[8] DEVRIENDT B,STUYVEN E,VERDONCK F,et al.EnterotoxigenicEscherichiacoli(K88) induce proinflammatory responses in porcine intestinal epithelial cells[J].DevCompImmunol,2010,34(11):1175-1182.

[9] SHINKAI H,SUZUKI R,AKIBA M,et al.Porcine Toll-like receptors:recognition ofSalmonellaentericaserovar Choleraesuis and influence of polymorphisms[J].MolImmunol,2011,48(9-10):1114-1120.

[10] SHINKAI H,ARAKAWA A,TANAKA-MATSUDA M,et al.Genetic variability in swine leukocyte antigen class II and Toll-like receptors affects immune responses to vaccination for bacterial infections in pigs[J].CompImmunolMicrobiolInfectDis,2012,35(6):523-532.

[11] DOMINGUEZ M A,LANDI V,MARTíNEZ A,et al.Identification and functional characterization of novel genetic variations in porcineTLR5 promoter[J].DNACellBiol,2014,33(7):469-476.

[12] WU Z C,LIU Y,DONG W H,et al.CD14 in the TLRs signaling pathway is associated with the resistance toE.coliF18 in Chinese domestic weaned piglets[J].SciRep,2016,6:24611.

[13] BAUER A P,LEIKAM D,KRINNER S,et al.The impact of intragenic CpG content on gene expression[J].NucleicAcidsRes,2010,38(12):3891-3908.

[14] 劉 利,高 雪,高會(huì)江,等.DNA甲基化在奶牛金黃色葡萄球菌性乳房炎中的調(diào)控[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(10):1554-1558.

LIU L,GAO X,GAO H J,et al.Regulation of DNA Methylation duringStaphylococcusaureusmastitis in dairy cattle[J].ActaVeterinariaetZootechniaSinica,2012,43(10):1554-1558.(in Chinese)

[15] SHA A H,LIN X H,HUANG J B,et al.Analysis of DNA methylation related to rice adult plant resistance to bacterial blight based on methylation-sensitive AFLP (MSAP) analysis[J].MolGenetGenomics,2005,273(6):484-490.

[16] LUO J,YU Y,CHANG S,et al.DNA methylation fluctuation induced by virus infection differs between MD-resistant and -susceptible chickens[J].FrontGenet,2012,3:20.

[17] 包文斌,潘章源,朱 璟,等.豬TLR4基因在F18大腸桿菌抗性型和敏感型資源群體間的差異表達(dá)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(2):278-283.

BAO W B,PAN Z Y,ZHU J,et al.Differentiation of porcineTLR4 Gene mRNA expression between resistant and sensitive resource populations to ETEC F18[J].ActaVeterinariaetZootechniaSinica,2011,42(2):278-283.(in Chinese)

[18] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[19] BARTON G M,MEDZHITOV R.Toll-like receptor signaling pathways[J].Science,2003,300(5625):1524-1525.

[20] BAILEY M.The mucosal immune system:Recent developments and future directions in the pig[J].DevCompImmunol,2009,33(3):375-383.

[21] LIN S C,LO Y C,WU H.Helical assembly in the MyD88-IRAK4-IRAK2 complex in TLR/IL-1R signalling[J].Nature,2010,465(7300):885-890.

[22] SU X Q,LI S,MENG M,et al.TNF receptor-associated factor-1 (TRAF1) negatively regulates Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-β (TRIF)-mediated signaling[J].EurJImmunol,2006,36(1):199-206.

[23] MANUKYAN M,NALBANT P,LUXEN S,et al.RhoA GTPase activation by TLR2 and TLR3 ligands:connecting via Src to NF-κB[J].JImmunol,2009,182(6):3522-3529.

[24] ZHAO X L,XIAO S Y,BERK S,et al.Structural basis of Phosphoinositide (PIP) recognition by the TIRAP PIP-binding motif[J].BiophysJ,2015,108(2):93a.

[25] BROWN J,WANG H,HAJISHENGALLIS G N,et al.TLR-signaling networks:an integration of adaptor molecules,kinases,and cross-talk[J].JDentRes,2011,90(4):417-427.

[26] XIAO Z Z,WANG C,MO D L,et al.Promoter CpG methylation status in porcine Lyn is associated with its expression levels[J].Gene,2012,511(1):73-78.

[27] SUN L,WANG J,YIN X M,et al.Identification of a 5-methylcytosine site that may regulate C/EBPβ binding and determine tissue-specific expression of theBPIgene in piglets[J].SciRep,2016,6:28506.