巨噬細胞-γδ T細胞免疫軸在豬格拉瑟氏病發(fā)病機制中的作用

程 蕾，陳洪波

(1.武漢市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208；2. 武漢輕工大學動物科學與營養(yǎng)工程學院，武漢 430023)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)被公認為是對保育豬乃至肥育豬和母豬構成嚴重威脅的重大細菌性病原體之一[1]；也是豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)的一種主要原發(fā)性病原[2]。Hps感染可導致敗血癥以及全身系統(tǒng)性炎癥，其中以格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)為典型特征；Hps存在于世界各主要養(yǎng)豬國家，感染的發(fā)病率和死亡率較高(隱性群中可達75%)且疾病流行正呈上升趨勢[1]。針對該細菌，依賴抗生素的治療策略已不符合行業(yè)發(fā)展趨勢，預防使用的滅活疫苗存在很大弊端，而新型疫苗的開發(fā)研究仍面臨諸多挑戰(zhàn)[3]?？共∮N有助于促進豬場疫病凈化，《全國畜禽遺傳資源保護和利用“十三五”規(guī)劃》中也已將抗病型新品種/配套系的分子育種作為今后的重點研究方向。

筆者根據PubMed(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)和GoPubmed?(www.gopubmed.org)檢索、分析，結果顯示，我國Hps研究全球居首，相關文獻總量超過25%(截至2017年8月)，這也從側面反映了我國目前針對該菌感染流行所面臨的嚴峻形勢。目前Hps感染的致病機制研究相對較少，總體上，“宿主-病原互作”(12%)和“宿主應答”(4%)合計占到總文獻數量的16%(圖1)；尤其是部分研究層面仍缺乏深入和系統(tǒng)解析。盡管有結果表明不同豬對該菌存在抗性差異[4]，但其分子遺傳機制不甚清楚，相關致因突變尚不明確。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Hps感染可引起肺部等器官中產生大量替代激活的巨噬細胞(即Ⅱ型MΦ)并伴隨細胞膜糖蛋白CD163分子的顯著上調表達[5]；最近研究表明，強毒力Hps菌株感染后豬肺泡巨噬細胞(PAM)表面CD163的高表達以及可溶性sCD163脫落(至外周血中)是區(qū)別于無毒力菌株感染的最主要特征[6]。然而，MΦ/sCD163對Hps感染的影響及其調控宿主免疫應答的分子機制還不清楚。針對這一重要生物學現(xiàn)象，本文擬通過深入、系統(tǒng)綜述相關研究進展，進一步理清Hps感染致病的核心脈絡；旨在探討病原-宿主互作過程中細菌免疫逃避對宿主細胞的重要影響，展望將來需要研究的關鍵問題；在對豬分子抗病育種迫切需求的現(xiàn)實背景下為Hps抗性品質改善提供遺傳基礎。

圖1 副豬嗜血桿菌感染相關研究的文獻分類(文獻數據根據PubMed數據庫搜索結果整理)Fig.1 Literature searching and classification on Hps infection (data from: PubMed)

1 Hps感染與肺免疫防御失敗

Hps(以下“Hps”除非特別說明均指毒力或者強毒力菌株) 傳播主要是通過與易感動物或者病豬接觸發(fā)生，而疾病暴發(fā)通常與單一流行的菌株密切有關[1]。Hps早期在仔豬上呼吸道定居期間可表達一種IgA蛋白酶，從而破壞豬IgA重鏈結構以逃避宿主黏膜免疫[7]，這為細菌入侵提供了有利條件。J. L. Vahle等[8]對仔豬經鼻腔接種后圍繞細菌入侵的動態(tài)特征進行了分析，發(fā)現(xiàn)可最早從肺中分離出細菌，暗示：突破肺部防御是Hps系統(tǒng)性擴散的必經之路。PAM是肺部防御中第一道防線，Hps侵入肺期間毫無例外地會與之發(fā)生“交鋒”。遺憾的是，盡管有少量毒力菌株被PAM吞噬并殺滅，但與無毒菌株相比，PAM吞噬毒力Hps細菌的效率很低，表現(xiàn)出對PAM存在較強的吞噬抗性，細菌莢膜以及其他未知蛋白成分可能在吞噬抗性中發(fā)揮一定作用[9]；有研究發(fā)現(xiàn)，VtaA8、VtaA9是Nagasaki菌株抵抗PAM吞噬的重要毒力因子[10]。最終結果是：Hps對于PAM具有吞噬抗性，這為細菌在肺泡內大量增殖提供了重要窗口期。

一般認為，病原體感染會導致組織微環(huán)境中發(fā)生局部炎癥反應，從而促使感染部位毛細血管壁通透性增加，并募集吞噬細胞。盡管肺炎并非Hps感染的典型癥狀，但是我們之前利用普通仔豬[11]和禁食初乳(colostrum-deprived, CD)仔豬[12]進行的體內感染試驗已多次證實確有肺炎發(fā)生。體內感染試驗顯示，Hps導致PAM中一些參與炎癥反應基因顯著上調[13]，這與在易感豬肺中觀察到的結果類似[14]。而且，我們研究發(fā)現(xiàn)，在Hps感染的炎癥部位可能會于募集的吞噬細胞中通過S100鈣粒蛋白家族成員介導的TLR4-NF-κB/ERK或/和RAGE-ERK信號形成強烈的促炎反應正反饋[15]。如前面所述，毒力Hps菌株對PAM具有吞噬抗性；而我們利用CD仔豬經氣管內攻毒后第3天成功從外周血中分離出了Hps[12]，由此證明：炎癥反應期間募集而來的吞噬細胞未能對Hps實施有效殺滅。所以，由Hps與PAM“交鋒”而引發(fā)的局部組織炎癥其實是打開了細菌進入血流的門戶。盡管我們以及其他課題組曾發(fā)現(xiàn)Hps感染可導致補體級聯(lián)中相關基因被顯著上調[11, 13]，但有證據表明，Hps某些毒力因子可通過阻止補體分子結合抑制經典補體級聯(lián)激活途徑[16]，Hps菌體莢膜的存在也不利于補體分子充分發(fā)揮對細菌的調理[17]，補體介導的Ⅱ型吞噬作用也以失敗告終。總之，血清/補體抗性是Hps的一種重要毒力機制[18]，為細菌通過血液循環(huán)向重要組織部位的入侵提供了保證。

基于以上分析可以初步得出結論：Hps沉積到下呼吸道之后，肺是病菌引發(fā)全身性感染的原發(fā)性侵入位點，而這歸咎于宿主PAM免疫保護失敗以及由PAM引發(fā)的炎癥反應。

2 Hps感染導致肺中MΦ替代激活

MΦ是哺乳動物免疫應答體系中重要的免疫細胞類型。但同時，MΦ還是諸多細菌性病原體逃避宿主免疫防御的靶細胞，尤其是那些具備系統(tǒng)性擴散特點的細菌[19]。較早的研究顯示，強毒力Hps一旦被PAM內化便不可能在其中存活，因此認為：Hps被MΦ內化并非該細菌的侵入機制[9]。對此結論，我們并不完全贊同。理由如下：體外感染試驗證明，Hps可通過抑制PAM中活性氧(ROS)的產生阻止PAM呼吸爆發(fā)[20]；此外，體內感染導致PAM中CORONIN1A基因顯著下調，暗示Hps可能通過抑制溶酶體傳遞以利于其在細胞內的存活[13]；B. Bello-Orti等[21]發(fā)現(xiàn)，體內感染后4 d能夠成功從肺部吞噬細胞(MΦ和嗜中性粒細胞)以及肺細胞中檢出強毒力Hps，而無毒菌株感染后不能從這些細胞中檢出，其具體分子機制尚有待研究。以上結果表明，吞噬細胞對強毒力Hps的殺滅是無效的，也與我們前面得出的結論一致。

組織微環(huán)境中，MΦ的功能依賴其不同的活化狀態(tài)，盡管這在不同物種之間可能存在一定差別；基本上講，經典激活可由IFN-γ和 LPS誘導產生CAMs(即Ⅰ型MΦ，M1)，對病原體殺滅能力強，主要分泌促炎細胞因子(如IL-1β、TNF、IL-6、IL-12和 IL-23)以及強氧化物質(如NO)；替代激活可由IL-4和IL-13誘導產生AAMs(即Ⅱ型MΦ，M2)，對病原體殺滅能力差，主要通過分泌胞外基質成分以利于組織損傷修復；另外，其他類型的AAMs可由IL-10等因子誘導，但與通常所說的Ⅱ型MΦ在細胞表型上存在一定差別，主要發(fā)揮抗炎反應作用[22]。我們對本課題組以及其他研究小組的基因芯片數據進行了深入整合分析，結果發(fā)現(xiàn)Hps感染導致MΦ替代激活的一系列標志基因顯著上調，其中就有Ⅱ型MΦ標志基因CD163[5]。筆者利用QPCR和IHC技術對肺組織中相關基因分別從轉錄和蛋白水平進行分析后發(fā)現(xiàn)：Hps感染的MΦ替代激活依賴STAT3和STAT6；值得一提的是，筆者還發(fā)現(xiàn)個別Ⅱ型MΦ標志基因(如FN1和IRF4)于感染后下調表達，而促炎細胞因子IL-8顯著上調(未發(fā)表數據)；華南農業(yè)大學廖明老師課題組利用毒力菌株SC096外膜蛋白OmpP2對PAM細胞系3D4/31免疫刺激后同樣發(fā)現(xiàn)IL-8等促炎細胞因子被顯著上調[23]，與前面所提Y. Wang等[13]的研究工作一致。這表明：Hps感染過程中雖然MΦ以替代激活為主，但同時也可能兼有Ⅰ型MΦ產生。血液中單核細胞是MΦ的前體細胞，與Hps感染類似，B. Saha等[24]發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒(HCV)刺激人的單核細胞后導致其朝Ⅱ型MΦ激活為主，但同時也有少量Ⅰ型MΦ產生；令人驚訝的是，他們發(fā)現(xiàn)阻斷IL-1β受體IL1RA之后Ⅱ型MΦ激活竟然被同步抑制(伴隨抗炎細胞因子TGF-β下調)。人們研究證明，Ⅱ型MΦ表面標志CD163已被證明是諸多G+和G-細菌激活機體(單核/巨噬細胞)先天免疫應答的感受器，可導致較強烈的局部炎癥反應；但與TLRs(Toll-like receptors)僅識別細菌破裂后被釋放出的PAMP(pathogen-associated molecular pattern)成分(如脂多糖LPS)不同，CD163是通過識別完整的菌體而達到促炎效應的[25]。我們推測MΦ經典激活與替代激活并非完全意義上的“對抗”關系，還存在“協(xié)作”機制；而CD163被證明是炎癥反應的感受器啟發(fā)我們需要深入認識豬中Ⅱ型MΦ對于Hps的感染調控。一項重要研究發(fā)現(xiàn)，Hps經體內感染后第2天豬肺中CD163highPAM急劇增多，隨后第3—4天于血清中檢測到了高水平的sCD163和IL-8，并伴隨更加嚴重的臨床感染表現(xiàn)(如敗血癥)，是區(qū)別于無毒力Hps感染的典型特征[6]。血液中高水平sCD163已被證明與人的多種疾病有關，其中就包括與Hps感染類似的菌血癥、敗血癥和關節(jié)炎[26]。所以，這極可能代表了感染后期單核/巨噬細胞面對嚴重炎癥反應而做出的一種免疫關閉機制。

以上分析進一步表明，肺作為Hps的原發(fā)性侵入位點，其PAM并不能對細菌實施有效殺滅。再者，由于利用Hps體外直接感染PAM并不能重復體內感染的試驗結果[6]，我們懷疑，肺中PAM在接觸到Hps后極可能是通過其表面的CD163于局部組織處引發(fā)最初的炎癥反應，隨后募集而來的嗜中性粒細胞將炎癥信號進一步放大，隨著大量單核細胞募集至感染部位，Hps-單核細胞互作誘導單核細胞向Ⅱ型MΦ活化，而此間形成的少量Ⅰ型MΦ非但不足以殺滅細菌，還有可能在Ⅱ型MΦ產生的過程中起到“協(xié)助”作用；最終導致大量單核細胞源性CD163highPAM的產生，并促成后續(xù)的嚴重感染。

3 巨噬細胞-γδ T細胞免疫軸在Hps感染中的作用

盡管疫苗預防存在諸多不足[3]，但Hps滅活苗或部分開發(fā)中的亞單位疫苗具有較好的免疫保護效果，表現(xiàn)為豬外周血中CD4+CD8α-Th細胞、CD3ε+CD8α+CD8β+CTL細胞以及CD21+αIgM+B細胞的顯著增多和較高的抗體(IgG)水平[27-29]；此外，與補體介導的Ⅱ型吞噬作用相比，抗體介導的Ⅰ型吞噬作用更加有效[4]，說明：體液免疫對于控制細菌感染是必須的。但是在不實施免疫預防的條件下，毒力Hps菌株感染后不僅導致先天免疫“全線失守”(見前述)，而且體液免疫應答也不能被有效激活，那么這其中的原因是什么呢？我們曾最早對Hps感染后宿主免疫應答的轉錄組變化(脾)進行了研究，首次發(fā)現(xiàn)感染可導致豬Ⅰ類和Ⅱ類抗原遞呈分子(SLA)顯著下調表達[11]。對此，后來又有研究在肺、PAM、外周血單核細胞中進一步證實[6, 13-14, 29]。這表明：Hps感染可削弱宿主免疫細胞的抗原提呈功能并可能嚴重影響體液免疫應答。

如前面所述，因為MΦ/sCD163(或者PAM/CD163)可能是Hps引起宿主免疫應答的原發(fā)性信號，那么，這對于宿主體液免疫應答有無影響？細胞膜糖蛋白CD163隸屬富含半胱氨酸結構域的清道夫受體(SRCR)家族，幾乎在MΦ和單核細胞中特異表達；是觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hb)的胞吞受體和有核紅細胞的黏附受體，在氧化損傷、紅細胞生成以及介導“完整”細菌觸發(fā)先天免疫應答中具有重要作用[25]。人和鼠中研究表明，CD163可被抗炎細胞因子IL-10上調表達，而被促炎細胞因子(如TNFα、IFN-γ等)下調表達，這種免疫調節(jié)也說明CD163主要存在于Ⅱ型MΦ[26]；與之對應，我們前期研究發(fā)現(xiàn)伴隨Hps感染導致巨噬細胞發(fā)生替代激活，CD163負調控因子IFN-γ在肺中被顯著下調(未發(fā)表數據)。CD163由9個胞外SRCR結構域和一個連有胞質尾區(qū)的短跨膜區(qū)組成，現(xiàn)已證明其9個胞外SRCR蛋白結構域在功能上有所區(qū)別[25]。與CD163相比，sCD163包含所有9個胞外SRCR蛋白結構域，由細胞上CD163脫落后形成；炎癥狀態(tài)下，MΦ和單核細胞中金屬蛋白酶ADAM17/TACE被激活后可將CD163從細胞膜上“切掉”導致血漿中可溶性sCD163顯著升高；組織金屬蛋白酶抑制因子 3(TIMP-3)則是sCD163脫落的抑制因子[26]。最近發(fā)現(xiàn)，Hps感染后肺組織中金屬蛋白酶ADAMTS17被顯著上調[30]，但Hps感染后期血漿中sCD163急劇升高[6]是否與該基因之間存在調控關系尚不得而知。

目前sCD163的具體功能還不清楚，在人的研究表明血漿中sCD163可抑制T淋巴細胞增殖與活化[31]，具體機制不詳。我們發(fā)現(xiàn)，Hps感染CD仔豬后1～3 d外周血總淋巴細胞數急劇下降，對感染前后(第0、1、3天)外周血總白細胞利用RNA-Seq分析表明淋巴細胞的增殖與活化功能(含T細胞)被顯著抑制，并且與巨噬細胞替代激活信號Jak/stat (STAT3)密切關聯(lián)(未發(fā)表數據)。與此對應，R. Frandoloso等[29]發(fā)現(xiàn)Hps感染1和2 d后豬外周血中CD3+γδ TCR+細胞分別減少31.8%和74.3%。以上研究表明，宿主細胞免疫應答中γδ T細胞極可能是細菌感染的主要靶細胞。豬γδ T細胞的具體功能我們還知之甚少[32]，人和鼠中研究表明，該類型細胞在免疫記憶、抗原遞呈(依賴MHC和不依賴MHC)、細胞毒性等免疫調節(jié)方面均發(fā)揮重要作用，參與病毒、真菌等一系列病原微生物的免疫防御；鼠中γδ T細胞缺乏表現(xiàn)出對沙門菌明顯易感[33]。需要特別指出，人和鼠外周血T淋巴細胞中γδ T細胞僅占0.5%～5%，而豬屬于“高γδ T細胞物種”，外周血中γδ T細胞占總T淋巴細胞的70%以上，占總淋巴細胞(PBL)的30%～85%，具體含量因日齡而異，尤其在新生仔豬中最高；此外，哺乳母豬初乳中γδ T細胞含量也很高，占外周血淋巴細胞(PBL)的15%[34]。

4～8周齡仔豬是Hps的主要易感豬群，鑒于感染導致γδ T細胞含量急劇下降，我們懷疑，Hps感染可能通過某種機制嚴重破壞γδ T細胞介導的幼齡仔豬免疫功能；伴隨γδ T細胞下降，T淋巴細胞增殖活化潛在抑制因子sCD163水平卻急劇升高。暗示：巨噬細胞/sCD163可能通過與下游γδ T細胞形成一個關系緊密的“巨噬細胞/sCD163-γδ T細胞” 免疫軸調節(jié)宿主對Hps的抗性。

4 CD163是調控豬對Hps抗性的候選基因？

圍繞前面對巨噬細胞/sCD163-γδ T細胞免疫軸的剖析，我們推測CD163可能是影響豬對Hps抗性的候選基因。此外，以下事實也可為該推測提供旁證：第一，如前所述Hps感染后CD163是顯著差異表達基因，尤其CD163highPAM于感染后顯著增多以及隨后血漿中sCD163急劇上升是區(qū)別于無毒菌株感染的最明顯特征[6]；第二，我們分析發(fā)現(xiàn)CD163在人和豬中高度保守，其中細菌結合功能域[25]相似性達89%，暗示豬單核/巨噬細胞表面CD163可能是Hps引發(fā)炎癥反應的重要受體。一方面，Hps感染導致單核細胞向Ⅱ型MΦ活化并上調表達CD163，另一方面sCD163抑制豬γδ T細胞增殖活化，二者在免疫應答過程中緊密銜接、逐層推進，最終導致宿主免疫防御失敗，因此CD163可能也是宿主“巨噬細胞/sCD163-γδ T細胞”免疫軸上調控Hps感染的關鍵點；第三，研究表明，CD163與豬的其他重大感染性疾病密切相關，如口蹄疫病毒(FMDV)、胸膜肺炎放線桿菌(APP)、豬鏈球菌(S.suis2)感染[35-37]。再者，美國Iowa州立大學C. K. Tuggle教授團隊證明CD163是豬沙門菌感染的抗性基因，其SNP位點與糞便和組織中細菌含量顯著相關[38]；而且，豬CD163基因3′-UTR區(qū)一SNP位點還與血液IgG抗體水平顯著相關[39]。P. X. Niu 等[40]發(fā)現(xiàn)，CD163中一SNP與PRRSV感染后11 d核衣殼蛋白特異性抗體滴度顯著相關，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術將豬巨噬細胞CD163中編碼SRCR5的功能域序列敲除后表現(xiàn)出對PRRSV感染的完全抗性[41]。這表明，CD163是豬病原體感染的重要候選基因。

5 展 望

綜上所述，豬“巨噬細胞/sCD163-γδ T細胞”可能是調控Hps感染的關鍵免疫軸：PAM通過其表面CD163在原發(fā)性侵入位點肺中引發(fā)炎癥反應，隨后被募集的單核細胞在Hps感染下發(fā)生Ⅱ型MΦ替代激活并引發(fā)其表面CD163脫落為sCD163，sCD163導致外周血中γδ T增殖活化被抑制，最終嚴重發(fā)病(圖2)。迄今為止，我們已經證實Hps感染可導致巨噬細胞發(fā)生替代激活，但諸多問題仍亟需進一步研究。鑒于不同Hps毒力菌株與宿主之間的互作存在一定的特殊性，深入探討CD163介導Hps感染的促炎機制、明確Hps誘導單核細胞發(fā)生替代激活以及導致sCD163脫落的分子機制、分析sCD163對γδ T細胞的免疫抑制都是今后需要著重解決的問題，這將有助于我們深入理解Hps致病的分子機制，為豬抗病育種的遺傳改良提供分子標記篩選新視角。

圖2 巨噬細胞-γδ T細胞免疫軸在豬格拉瑟氏病發(fā)病機制中的作用Fig.2 The proposed MΦ-γδ T immune axis in the pathogenesis of Gl?sser’s disease

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