牛全基因組拷貝數(shù)變異研究進展

裴生偉，王 麗，曹學濤，李萬宏，李發(fā)弟，3，樂祥鵬*

(1.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州 730020；2.農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州 730020；3.甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，民勤 733300)

隨著基因組學和生物信息學的不斷發(fā)展，基因組結構變異研究的不斷深入，學者們挖掘出越來越多的基因組結構變異類型?？截悢?shù)變異(Copy number variations, CNV)成為繼簡單重復序列(Simple sequence repeat, SSR)和單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)之后一種新的基因組結構變異類型。2006年R.Redon等[1]結合SNP基因分型和微陣列比較基因組雜交技術(Array-based comparative genomic hybridization, aCGH)對270個人的全基因組進行了CNV鑒定，構建了人的第一張CNV圖譜，并將獲得的大量CNV數(shù)據(jù)儲存在基因組變異數(shù)據(jù)庫中(The Database of Genomic Variants, DGV)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，CNV覆蓋比例可達到人類基因組的12%[2]?？茖W家們對許多模式動物，如果蠅[3]、黑猩猩[4]、小鼠[5]的CNV研究發(fā)現(xiàn)，CNV和不同類型疾病的發(fā)生具有很強的關聯(lián)性。在牛上，2010年G.E.Liu等[6]利用aCGH技術第一次在全基因組水平分析了17個品種共計90頭 牛的全基因組CNV，發(fā)現(xiàn)一些特異性的拷貝數(shù)變異區(qū)(Copy number variation regions, CNVRs)與不同生產(chǎn)類型的牛品種密切相關。因此，本文對牛全基因組CNV的研究進展進行全面總結，以期為牛CNV今后的研究提供一定的指導信息。

1 CNV的定義及形成機制

DNA序列的復雜變異為物種表型的變異奠定了分子基礎，從單個堿基到染色體畸變，變異類型分為單核苷酸多態(tài)性(SNP)、寡核苷酸的插入缺失(Indels)、拷貝數(shù)變異(CNV)、基因組結構變異(SV)4種形式[7]。J.L.Freeman和S.W.Scherer等[8-9]研究表明，拷貝數(shù)變異(CNV)是基因組結構變異(SV)的重要組成部分，主要指1 kb～5 Mb的DNA片段拷貝數(shù)改變，這些片段的缺失、重復、倒位和易位統(tǒng)稱為CNV。隨著新一代測序技術和相應運算程序的結合發(fā)展，越來越小的具有拷貝數(shù)突變性質(zhì)的DNA片段被識別，CNV的定義也隨之發(fā)生改變。2011年，R.E.Mills等[10]將CNV定義為個體之間基因組序列上>50 bp片段的插入、缺失及其它復雜變異。

染色體結構的改變主要表現(xiàn)為同源重組(Homologous recombination, HR)和非等位同源重組(Non-allelic homologous recombination, NAHR)兩種機制[11]。NAHR是產(chǎn)生CNV的重要機制，主要發(fā)生在減數(shù)分裂時期的DNA損傷修復過程中，往往位于同源重復區(qū)(Segmental duplication, SD)或低拷貝的重復區(qū)內(nèi)(Low copy repeats, LCRs)[12]。同源序列的倒位[13]、重復或缺失都會造成特定基因拷貝數(shù)的改變進而導致染色體結構的改變[14]。此外，基于DNA損傷及錯誤重復修復的非同源末端連接(Non-homologous end-joining, NHEJ)、重復叉停滯及模板交換(Fork stalling and template switching, FoSTeS)和微同源序列介導重復和重組(Microhomology-mediated replication-dependent recombination, MMBIR)也是產(chǎn)生CNV的重要途徑[15]。NHEJ與NAHR的形成特征不同，它是在兩個重組末端之間不具有高同源序列的基礎上仍然能夠發(fā)生DNA斷端連接，導致染色體重排的發(fā)生(圖1)。

圖1 CNV形成的3種機制原理圖[16]Fig.1 Comparisons of the 3 major mechanisms underlying CNV formation[16]

2 CNV在牛全基因組上的分布特點

CNV在?；蚪M上的分布特點在一定程度上反映了CNV的形成機制及不同牛種的選擇壓和馴化歷史特點。?；蚪M上CNV的分布具有非隨機性。通過比對不同染色體上總CNV長度與其染色體長度的比值發(fā)現(xiàn)CNV的豐度在不同染色體中存在顯著差異，其中含CNV豐度較高的染色體為5、15、18、27、29和X[17]。研究同時發(fā)現(xiàn)，這些染色體上富含片段重復序列(Segmental duplication, SD)，說明?；蚪M中的SD與高頻率CNV存在極顯著正相關[18]，也證實SD是拷貝數(shù)變異發(fā)生的熱點區(qū)域和主要誘導形式[6, 19-20]。牛基因組上CNV的長度在100～200 kb范圍內(nèi)所占的比例最高。此外，不同牛品種的CNV數(shù)量和在染色體上的分布位置也存在很大的差異，暗示CNV數(shù)量和分布位置的差異與不同牛品種的生存環(huán)境及受到的選擇壓密切相關[21]。G.E.Liu等[22]研究表明，瘤牛和非洲普通牛種的CNV豐度遠大于歐洲普通牛種，這種差異主要是由不同牛種的分化程度、歷史有效群體大小、基因滲入和選擇壓所導致[23]。

3 全基因組CNV研究方法

隨著基因組學與生物信息學的快速發(fā)展，各類基因組CNV檢測技術和相應運算程序的運用使全基因CNV的研究更加全面深入。目前檢測全基因組CNV的方法主要有兩大類、一類是以核苷酸互補雜交為基礎的比較基因組雜交(aCGH)和SNP芯片檢測方法，另一類是以測序為基礎的新一代直接測序技術(Next-generation sequencing, NGS)[24]。研究者們利用3種全基因組CNV檢測方法對牛基因組CNV進行了大量的研究，并取得了很大的進展(表1)。

表1 ?；蚪MCNV研究匯總Table 1 Summary of CNV surveys performed in cattle

3.1 比較基因組雜交技術檢測全基因組CNV

比較基因組雜交(CGH)是首次應用于全基因組范圍內(nèi)檢測CNV的有效方法。其原理是在一張有固定探針的特制芯片上用不同的熒光素分別標記試驗樣本和對照樣本并進行共雜交，通過特定儀器檢測試驗樣本和對照樣本之間熒光比率的變化來確定試驗樣本的相對拷貝數(shù)變化。aCGH的分辨率主要取決于制備芯片過程中固定在芯片上探針的密度和片段大小，為了識別更多更有效的CNV，科學家通過增加芯片中探針密度及制備更短的探針，結合更高的信噪比，不斷提高CNV的檢測效率。根據(jù)芯片制作過程中探針的來源可細分為細菌人工染色體CGH芯片(Bacterial artificial chromosome-comparative genomic hybridization, BCA-CGH)和寡核苷酸探針CGH芯片(Oligo-CGH)。其中BCA-CGH芯片具有較高的信噪比，但分辨率較低，很難檢測到50 kb以下的CNV信號，制備芯片的代價昂貴，費時費力。Oligo-CGH芯片則具有高精度、高分辨率、易制備的優(yōu)點[29]。

3.2 SNP芯片技術檢測全基因組CNV

CNV也可以通過SNP芯片技術檢測，SNP芯片不需要同時使用兩個樣本的DNA(試驗組和對照組)和探針進行雙雜交，通過比較測試樣本的信號強度與其他個體的強度確定每個位點的相對基因組拷貝數(shù)[30]。與CGH相比，SNP芯片的優(yōu)點在于鑒定CNV的同時還可判定其基因型，還可以顯示雜合性缺失[30]。但芯片上的探針都是以已知的CNV所構建，導致這種以核苷酸雜交為基礎的CNV檢測方法通常具有一些系統(tǒng)性的缺陷。比如不能檢測小片段的CNV、很難檢測位于SD區(qū)域中的CNV及發(fā)掘新的、無偏差的復雜突變[24]。

3.3 新一代測序技術檢測全基因組CNV

新一代測序技術是將研究個體測序序列與參考基因組比對并確定CNV，克服了微陣列雜交技術的固有缺陷，對基因組CNV的檢測具有很大優(yōu)勢[19]。首先，新一代測序技術相較于基于探針雜交的方法具有更高的分辨率和靈敏度；其次，應用測序技術可以鑒定位于SD序列內(nèi)的復雜結構變異，從而進一步促進芯片技術的升級[31]；最后，通過測序技術檢測CNV的費用持續(xù)下降，各種算法不斷成熟使得研究范圍和樣本量不斷擴大[32]。目前，新一代測序技術已廣泛應用于?；蚪MCNV的研究中[17, 25, 33-34]。

4 CNV的遺傳效應

CNV作為基因組結構變異的主要形式之一，在不同物種基因組上普遍存在。與SNP相比，CNV所涉及的核苷酸數(shù)目遠遠大于SNP，故其會造成基因組上大片段基因序列改變，進而導致基因結構的改變和基因表達量的變化[35]。例如，通過重復或缺失DNA片段對單個或多個基因的結構造成改變進而導致基因表達的增強或減弱，甚至喪失基因的功能[7, 16, 19]。2004年J.Sebat等[36]首次在人基因組研究中發(fā)現(xiàn)了大量的拷貝數(shù)多態(tài)性(Copy number polymorphisms，CNPs)，證實CNV基因參與調(diào)節(jié)神經(jīng)功能、細胞生長、物質(zhì)代謝和疾病發(fā)生。大量的研究報道CNV在人類疾病易感性方面扮演著重要角色，比如CCL3L1基因和HIV、AIDS[37]，F(xiàn)CGR3B基因和血管球性腎炎[38]，DEFB4A基因和克羅恩病[39]等。隨后人們進一步對其他物種，包括家禽[40]、豬[41-42]、狗[43]、綿羊[44]、山羊[45]、馬[46]、牦牛[47]等全基因組CNV的研究，發(fā)現(xiàn)涉及CNV的基因與復雜性狀及環(huán)境適應性相關，暗示CNV是揭示動物經(jīng)濟性狀和分析群體遺傳結構的重要工具。

4.1 CNV與牛數(shù)量性狀的相關關系

對人類和嚙齒類動物的研究提出，CNV在生物體的健康發(fā)育、疾病易感性評估、物種的演化等方面扮演重要的角色[16, 48]。目前，大量的研究報道了牛基因組上CNV和牛數(shù)量性狀密切相關，并將CNV作為研究復雜性狀的一種分子標記應用于全基因組關聯(lián)性分析(GWAS)中。M.Mielczarek等[7]研究表明，在牛基因組拷貝數(shù)變異類型中缺失型的比率遠遠大于重復型，大部分的缺失斷點依靠cGMP蛋白激酶的表達，而大多數(shù)擴增斷點鑒定為TRAC基因，在生物免疫過程中扮演重要角色。Y.H.Gao等[17]利用全基因組重測序技術研究4頭高乳脂、乳蛋白和4頭低乳脂、乳蛋白荷斯坦牛的CNV，發(fā)現(xiàn)差異CNVRs主要涉及脂質(zhì)和蛋白的代謝，并鑒定10個候選基因作為早期選育的分子標記。A.M.Duran等[49]利用Illumina芯片技術對荷斯坦奶牛CNV與牛奶體細胞數(shù)評分做了關聯(lián)性分析，通過SV 8.3.1和PENNCNV-CNVRULER兩種不同的檢測方法分別鑒定到7個和11個候選基因作為全基因組選擇的分子標記。Y.L.Hou等[50]通過對高、低剩余采食量(Residual feed intake, RFI)荷斯坦奶牛做全基因組CNV檢測，探討CNV和飼料利用效率的關系，發(fā)現(xiàn)高飼料利用率奶牛的特異CNV與炎癥反應和免疫應答相關，而低飼料利用率奶牛的特異CNV與骨骼和器官發(fā)育相關。

4.2 CNV和牛種群體遺傳結構的關系

基因組結構的變異是研究物種群體遺傳結構的重要資源。CNV為物種的馴化、選擇和品種形成提供重要的分子標記。CNV作為繼SNP和SSR之后研究基因組結構變異的一個新視角，能夠從不同角度探究物種群體遺傳結構的問題[6, 51]。通過研究不同遺傳背景、地理分布牛品種基因組的特異CNVRs，揭示牛種群體遺傳結構差異的遺傳學基礎[52-55]。L.Z.Zhang等[53]分析12個不同父系、母系起源的中國牛種CNVRs分布特點，并對不同起源牛種的CNVRs做聚類分析，確定了中國牛種之間的起源進化和群體結構。L.Y.Xu等[52]利用高密度SNP芯片分析了世界范圍內(nèi)8個牛種的CNV，結果顯示，不同牛種CNV與牛種地理分布和群體結構具有很強的關聯(lián)性，與先前基于SNP研究群體結構的結果相一致。

4.3 CNV對基因表達的劑量效應分析

人類基因組中有近一半的CNVRs與蛋白編碼區(qū)相重疊，CNV導致基因結構和劑量的改變，對物種進化、表型變異和疾病發(fā)生等產(chǎn)生重要影響[36]。大量的研究結果表明CNV和基因表達劑量存在非常復雜的關系[56-58]。研究者將這種復雜的關系歸結為“劑量效應”?！皠┝啃笔侵附Y構基因或者調(diào)控序列在基因組上的拷貝數(shù)目發(fā)生改變，從而引起相應基因表達水平和蛋白或者表型變化的現(xiàn)象[59]。通過分析CNV基因和其mRNA及蛋白表達水平的關系，將劑量效應分為劑量敏感型、劑量不敏感型CNV。將劑量敏感型CNV中能引起其mRNA及蛋白表達水平降低甚至失活的一類稱為劑量反轉(zhuǎn)型[56]。由于物種在長期的進化過程中形成的蛋白互作機制可以抵制劑量敏感型CNV對基因結構和劑量的改變[60]，因此絕大多數(shù)涉及CNV的基因與其mRNA及蛋白表達水平?jīng)]有顯著關系，表現(xiàn)為低水平的敏感性，即劑量不敏感型。

5 牛Y染色體CNV研究

牛Y染色體的雄性特異區(qū)(Male specific region of Y chromosome, MSY)在減數(shù)分裂過程中不與X染色體進行同源重組，而且含有大量重復序列的回文結構，導致很難獲得Y染色體的基因連鎖圖譜和準確的序列信息[61]。目前，牛全基因組CNV的研究僅局限在常染色體，而Y染色體CNV的研究只針對特定的多拷貝基因家族，這些多拷貝基因家族往往特異或主要地在睪丸中表達，暗示這些多拷貝基因和公牛精子發(fā)生、繁殖力密切相關[62]，其拷貝數(shù)變異可作為公牛繁殖力早期選育的有效分子標記。

通過研究雜種牛和純種牛Y染色體上與精子發(fā)生相關基因的拷貝數(shù)變異能夠為解釋牛種父系起源和繁殖力差異提供理論基礎。A.Mandal等[63]檢測了雜種牛(普通?！亮雠?和瘤牛Y染色體上4個與精子發(fā)生相關基因的絕對拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)SRY基因(Sex determining region on Y chromosome)拷貝數(shù)和TSPY基因(Testis-specific protein Y-encoded, TSPY)拷貝數(shù)在雜種牛中顯著高于瘤牛，并結合前人對于不同牛種Y染色體長度顯著差異的研究，推斷TSPY拷貝數(shù)的增加使得雜種牛的Y染色體增長[64]。G.W.Zhang等[65]通過研究HSFY、ZNF280BY、PRAMEY和TSPY在牦牛和犏牛中拷貝數(shù)的差異來揭示犏牛雄性不育的分子機制，發(fā)現(xiàn)在犏牛中TSPY基因的拷貝數(shù)顯著高于牦牛，認為TSPY基因拷貝數(shù)的異常增多會導致雄性犏牛的不育。

X.P.Yue等[66-67]對15個牛品種共460頭公牛的PRAMEY基因(Preferentially expressed antigen in melanoma, Y-linked)、ZNF280BY基因(Zinc finger protein 280B, Y-linked)和HSFY基因(Heat-shock transcription factor, Y-linked)的拷貝數(shù)變異進行了分析，發(fā)現(xiàn)3個基因的拷貝數(shù)在品種間和品種內(nèi)都存在顯著差異，其中普通牛血統(tǒng)牛種的PRAMEY和ZNF280BY中值拷貝數(shù)顯著低于瘤牛血統(tǒng)的牛種，而HSFY的中值拷貝數(shù)在普通牛血統(tǒng)的牛種中顯著高于瘤牛血統(tǒng)的牛種。這3個基因的CNV與荷斯坦公牛繁殖性狀的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，PRAMEY拷貝數(shù)和陰囊周徑(Scrotal circumference, SC)、相對陰囊周徑(Relative length of scrotal circumference, RLSC)、不返情率(Non-return rate, NRR)、正常精子比例(Percentage of normal sperm, PNS)呈顯著負相關[67]；ZNF280BY和HSFY拷貝數(shù)與SC和RLSC呈負相關，ZNF280BY基因與公牛授精后受配母牛受孕率(Sir conception rate, SCR)呈正相關[66]。C.K.Hamilton等[68]分析了14個牛品種中TSPY基因拷貝數(shù)變異情況，發(fā)現(xiàn)TSPY基因的拷貝數(shù)在種間和種內(nèi)也存在顯著差異，并發(fā)現(xiàn)TSPY基因拷貝數(shù)與56天NRR成正相關，而與其mRNA表達水平呈顯著負相關[57]。

6 牛全基因組CNV研究存在的問題與展望

6.1 牛全基因組CNV研究存在的問題

全基因組CNV的研究不斷地應用于牛GWAS、群體遺傳結構分析等方面，成為牛種重要經(jīng)濟性狀選擇和起源進化分析的有效工具。但目前的研究仍然受到一定的限制：第一，CNV的鑒定還沒有統(tǒng)一性的標準，使得不同研究的結果不能進行有效的整合分析；第二，目前使用的牛參考基因組僅為普通牛種(海福特牛)，這導致研究瘤牛品種全基因組尤其是Y染色體CNV時會造成一定程度的偏差；第三，目前許多全基因組CNV研究只是篩選了大量候選基因及區(qū)域，但并未深入研究其功能和作用機理。

6.2 牛全基因組CNV研究展望

CNV作為基因組結構變異的重要來源為物種復雜性狀的研究提供分子基礎。通過對不同牛種基因組CNV的研究，構建完整的全基因組CNV遺傳圖譜，為牛種基因組數(shù)據(jù)庫做進一步的補充。將牛種特異性的CNV與性狀及選擇壓相關聯(lián)，比較不同牛種之間的CNV，揭示品種間的遺傳變異，為優(yōu)良性狀選育和遺傳資源多樣性保護奠定基礎。此外，通過結合CNV和SNP為牛種全基因組關聯(lián)性分析(GWAS)，選擇重要經(jīng)濟性狀的候選基因提供有力支撐，從而加快育種進程和提高遺傳改良效果。

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