NOB1調(diào)控Wnt/ β-catenin信號(hào)通路影響膀胱癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

胡國森，吳曉杰

(河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科,河南洛陽 471000)

膀胱癌在中國泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率排名第1，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)的全部惡性腫瘤中位居第7位，手術(shù)治療、放化療等是目前膀胱癌治療的主要方法，隨著人們對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的不斷探索，靶向基因治療腫瘤逐漸成為腫瘤治療的重點(diǎn)[1-2]。酵母基因Noblp人類同源基因(nin ond bind protein，NOB1)與核糖體形成和溶酶體的合成有關(guān)，是一種與核糖體裝配有關(guān)的蛋白，其在人體組織中表達(dá)水平不同，在肺組織、肝臟等中表達(dá)水平較高，而在結(jié)腸、腎臟等組織中表達(dá)水平較低[3]。近年來的研究顯示，NOB1參與惡性腫瘤的發(fā)生，在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，而人為的下調(diào)腫瘤細(xì)胞中NOB1表達(dá)后，膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌等癌細(xì)胞的增殖能力降低，凋亡水平升高[4-5]。Wnt/β-catenin是Wnt多種信號(hào)通路中的經(jīng)典信號(hào)通路，參與腫瘤的發(fā)展，與細(xì)胞的凋亡等有關(guān)，參與細(xì)胞內(nèi)多種癌基因或者是抑癌基因生物學(xué)功能的作用過程[6-7]。本研究以膀胱癌細(xì)胞為研究對(duì)象，下調(diào)細(xì)胞中NOB1的表達(dá)，探討NOB1在膀胱癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制，以期為靶向NOB1治療膀胱癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料膀胱癌BIU-87細(xì)胞購自于上海信裕生物科技有限公司；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Permix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒購自于大連Takara；RNA simple總RNA提取試劑盒購自于北京天根；BCA Protein Assay Kit購自于碧云天；Annexin V 凋亡檢測試劑盒(FITC/PI雙染法)購自于上海生工；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)一抗、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)一抗購自于美國Cell Signaling CST；細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)一抗購自于美國Abcam；甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗購自于美國Sigma；NOB1 siRNA和siRNA control由山東維真構(gòu)建；NOB1、GAPDH引物由上海生工合成；Lipofectamine2000購自于美國Thermo；Wnt/β-catenin抑制劑XAV939購自于美國StemRD；電化學(xué)發(fā)光(Electro-Chemi-Luminescence，ECL)發(fā)光試劑盒購自于碧云天。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染膀胱癌BIU-87細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，在飽和濕度、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化。BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，用Lipofectamine2000分別在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NOB1 siRNA、siRNA control，并命名為干擾組、陰性組，同時(shí)以不做轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3qRT-PCR檢測NOB1水平對(duì)照組、陰性組、干擾組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2 d，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，步驟參照RNA simple總RNA提取試劑盒。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR Permix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，(95℃ 5 s,60℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為GAPDH，2-△△Ct法分析NOB1水平。NOB1 F：5′-GAAAGAACAACGCCCTGGAG-3′，R：5′-CAGCCTTGAGATGACCTAAGC-3′。GAPDH F：5′-CG GAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，R：5′-AGC CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.4Westernblot檢測NOB1水平對(duì)照組、陰性組、干擾組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2 d，提取細(xì)胞蛋白，用BCA Protein Assay Kit對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量。在蛋白樣品中加入1/4體積的5×上樣緩沖液，煮沸5 min。選用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳。蛋白上樣量為50 μg，80 V電壓觀察上樣緩沖液進(jìn)入到分離膠和濃縮膠的交界處，把電壓升高到120 V，待蛋白marker徹底分離后，停止電泳。轉(zhuǎn)膜：90 V 轉(zhuǎn)膜60 min。將膜放在5%脫脂奶粉中，搖床孵育60 min。按照NOB1一抗1∶800稀釋、GAPDH一抗1∶1 000稀釋，將膜放在一抗中，4℃孵育過夜。1∶2 000稀釋山羊抗兔二抗，室溫孵育60 min。ECL發(fā)光后，用Quantity-One分析條帶的吸光度值，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡對(duì)照組、陰性組、干擾組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2 d，加入500 μL的Binding Buffer混合后，加入5 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜聯(lián)蛋白 V-FITC(annexin V-FITC)，避光反應(yīng)15 min。在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。同時(shí)收集培養(yǎng)2 d的對(duì)照組、陰性組、干擾組細(xì)胞，Western blot檢測細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、cyclinD1水平，步驟同1.4。Cleaved Caspase-3一抗1∶600稀釋、β-catenin一抗1∶1 000稀釋、Cyclin D1一抗1∶800稀釋。

1.6抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響干擾組細(xì)胞加入10μmol/L的Wnt/β-catenin抑制劑XAV939記為干擾+XAV939組，培養(yǎng)2 d后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Western blot檢測Cleaved Caspase-3、β-catenin、CyclinD1蛋白水平，步驟同1.4和1.5。

2 結(jié) 果

2.1NOB1siRNA降低細(xì)胞中NOB1mRNA和蛋白水平陰性組細(xì)胞中NOB1 mRNA和蛋白水平與對(duì)照組相比差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干擾組細(xì)胞中NOB1 mRNA和蛋白水平與對(duì)照組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NOB1 siRNA可以下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中NOB1水平(圖1、表1)。

圖1Westernblot檢測NOB1siRNA降低細(xì)胞中蛋白表達(dá)

組別 NOB1 mRNANOB1蛋白對(duì)照組 1.00±0.00 0.65±0.06陰性組 1.02±0.11* 0.64±0.09*干擾組 0.41±0.05# 0.26±0.02#F值74.03436.767P值0.0000.000

注：與對(duì)照組比，t1=0.351,t2=0.193,*P>0.05;與對(duì)照組比，t1=10.358,t2=7.521,#P<0.05。

2.2下調(diào)NOB1促進(jìn)Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡陰性組細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3水平與對(duì)照組相比差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干擾組細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3水平與對(duì)照組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。下調(diào)NOB1促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞中Caspase-3活化(圖2、表2)。

組別 凋亡率Cleaved Caspase-3水平對(duì)照組11.62±1.24 0.54±0.06陰性組11.17±1.39* 0.58±0.04*干擾組39.25±3.64# 1.04±0.09#F值139.25052.241P值0.0000.000

注：與對(duì)照組比，t1=0.234,t2=0.736,*P>0.05;與對(duì)照組比，t1=14.334,t2=9.197,#P<0.05。

圖2 下調(diào)NOB1促進(jìn)Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

2.3下調(diào)NOB1抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活陰性組細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1水平與對(duì)照組相比差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干擾組細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1水平與對(duì)照組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。下調(diào)NOB1降低膀胱癌細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1表達(dá)水平，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活(圖3、表3)。

圖3Westernblot檢測下調(diào)NOB1細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)

組別β-cateninCyclin D1對(duì)照組0.44±0.04 0.61±0.05陰性組0.45±0.06* 0.64±0.07*干擾組0.21±0.03# 0.29±0.04#F值27.19737.633P值0.0010.000

注：與對(duì)照組比，t1=0.272,t2=0.671,*P>0.05;與對(duì)照組比，t1=6.247,t2=7.155,#P<0.05。

2.4Wnt/β-catenin抑制劑XAV939促進(jìn)細(xì)胞凋亡干擾+XAV939組細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3水平與干擾組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Wnt/β-catenin抑制劑XAV939促進(jìn)NOB1下調(diào)誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)NOB1和抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有協(xié)同作用，均能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡(圖4、表4)。

圖4Wnt/β-catenin抑制劑XAV939對(duì)細(xì)胞凋亡影響

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；B：Western blot檢測細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平。

組別凋亡率Cleaved Caspase-3水平干擾組35.26±3.170.95±0.08干擾+XAV939組47.72±3.94#1.37±0.12#

注：與干擾組比，t1=4.268,t2=5.044,#P<0.05。

2.5Wnt/β-catenin抑制劑XAV939下調(diào)β-catenin、CyclinD1蛋白水平干擾+XAV939組細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1水平與干擾組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Wnt/β-catenin抑制劑XAV939能夠進(jìn)一步降低NOB1下調(diào)對(duì)β-catenin、Cyclin D1的抑制作用，下調(diào)NOB1和Wnt/β-catenin抑制劑XAV939具有協(xié)同作用，均能夠抑制膀胱癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活(圖5、表5)。

圖5 Western blot檢測抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路后細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1蛋白的水平

組別β-cateninCyclin D1干擾組0.26±0.040.31±0.04干擾+XAV939組0.15±0.02#0.12±0.03#

注：與干擾組比，t1=4.260,t2=6.582,#P<0.05。

3 討 論

NOB1基因有8個(gè)內(nèi)含子、9個(gè)外顯子，位于16號(hào)染色體上，其編碼的蛋白質(zhì)由412個(gè)氨基酸組成，在其N端含有一個(gè)PIN結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由100個(gè)氨基酸組成，在其C端含有一個(gè)鋅帶結(jié)構(gòu)，PIN結(jié)構(gòu)與核糖體蛋白的生成有關(guān)，鋅帶結(jié)構(gòu)參與基因轉(zhuǎn)錄過程[8-9]。NOB1在處于生長期的細(xì)胞中大量表達(dá)，而在靜止的細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入靜止期時(shí)，NOB1蛋白能夠被26S蛋白酶體分解[10-13]。后續(xù)的研究報(bào)道表明，NOB1還參與40S核糖體的轉(zhuǎn)運(yùn)，其PIN結(jié)構(gòu)還可以與RNA酶結(jié)合，除此以外，NOB1在骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞周期、增殖、凋亡等過程中均具有重要作用[14-17]。黃偉翼等[18]的研究顯示，下調(diào)NOB1表達(dá)后的乳腺癌細(xì)胞惡性程度降低。本研究在膀胱癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了NOB1小干擾RNA，并通過qRT-PCR和Western blot結(jié)果驗(yàn)證成功構(gòu)建了NOB1下調(diào)的膀胱癌細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NOB1后的膀胱癌細(xì)胞凋亡率下降，說明抑制NOB1可以誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡，這與之前的研究報(bào)道相符合，說明NOB1表達(dá)下調(diào)后抑制腫瘤發(fā)展。

Caspase與細(xì)胞凋亡有關(guān)，該蛋白家族含有多個(gè)蛋白成員，根據(jù)在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用可以分為凋亡起始因子、執(zhí)行因子等，Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的凋亡執(zhí)行因子，正常狀態(tài)下，Caspase-3沒有活性，以酶原的形式存在，當(dāng)受到相關(guān)因子刺激后，活化水平升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Caspase-3活化也是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[19]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)NOB1表達(dá)后的膀胱癌細(xì)胞中Caspase-3活化水平升高，說明下調(diào)NOB1可以誘導(dǎo)Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Wnt/β-catenin在胚胎發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定維持等過程中具有重要作用，是Wnt中經(jīng)典的信號(hào)通路，該信號(hào)通路包含低脂密度蛋白受體相關(guān)蛋白、卷曲蛋白、β-catenin等多個(gè)組成部分，其中β-catenin是關(guān)鍵蛋白，β-catenin在正常的細(xì)胞中與細(xì)胞膜上的E-cadherin形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠被糖原合成激酶、酪蛋白酶等降解，當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活后，糖原合成激酶、酪蛋白酶等活性降低，導(dǎo)致β-catenin不能被及時(shí)降解，積累在細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)下游靶基因cyclinD1的表達(dá)[20-21]。研究顯示，Wnt/β-catenin在膀胱癌組織中過度激活，腫瘤組織中β-catenin、Cyclin D1水平升高，用Wnt/β-catenin抑制劑處理腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞的生長能力降低，細(xì)胞凋亡增多[22-23]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)NOB1后膀胱癌細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1水平下降，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制，用Wnt/β-catenin抑制劑作用后，細(xì)胞凋亡水平更高，說明Wnt/β-catenin抑制劑和下調(diào)NOB1具有協(xié)同作用。

我們的實(shí)驗(yàn)證明，下調(diào)NOB1可以通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞中Caspase-3的活化，為研究NOB1在腫瘤中的作用提供了理論依據(jù)，對(duì)于研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。靶向基因治療具有準(zhǔn)確性高、安全等優(yōu)點(diǎn)，NOB1可能是治療膀胱癌的潛在靶點(diǎn)。

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