高效液相色譜波長切換法同時測定百效丸中6種主成分的含量

張銘，馬麗穎

(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心，遼寧 沈陽 110032)

百效丸由玄參、巴豆霜、厚樸、川貝母、柴胡等12味中藥材加工而成，為棕紅色的大蜜丸，氣香、味涼、微辛，具有消積理滯、鎮(zhèn)驚化痰的功效，臨床用于寒熱凝結(jié)、停食宿水、腹疼腹脹、痰喘氣促、慢驚風癥等。百效丸收載于《中藥成方制劑第二冊》，現(xiàn)行質(zhì)量標準未對百效丸中任何成分進行定量測定[1]，也未檢索到對該制劑進行多組分測定的文獻報道，為全面控制本品質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜(HPLC)波長切換法同時測定處方中玄參[2]主成分哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷，巴豆霜主成分巴豆苷，厚樸[2]主成分和厚樸酚[3]、厚樸酚的含量，為提高百效丸質(zhì)量標準提供了數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(型號：Agilent 1100系列，生產(chǎn)廠家：美國安捷倫公司)； 電子天平(型號：AXS205DU型，生產(chǎn)廠家：梅特勒-托利多儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(型號：KQ3200DB型，生產(chǎn)廠家：昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥與試劑百效丸來源于天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，批號分別為162156、162175、162182；乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑為分析純；哈巴苷對照品(111729-201506)、哈巴俄苷對照品(111730-201508)、巴豆苷對照品(111856-201001)、和厚樸酚對照品(110730-201614)、厚樸酚對照品(110729-201513)均購于中國食品藥品檢定研究院；安格洛苷C對照品(115909-22-3)購于上海寶曼生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件采用Venusil MP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：乙腈-甲醇(1∶4)，流動相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脫(0～20 min，48.0%A；20～26 min，48.0%A→54.0%A；26～35 min，54.0%A→60.0%A；35～49 min，60.0%A→75.0%A；49～55 min，75.0%A→48.0%A)；0～20 min時在210 nm[4-7]波長下檢測哈巴苷，20～26 min在280 nm[4,6,8-9]波長下檢測安格洛苷C和哈巴俄苷；26～55 min在294 nm[10-11]波長下檢測巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚；柱溫：30 ℃；進樣量為10 μL；流速：0.9 mL·min-1。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液 分別精密稱取對照品哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚各適量，用50%甲醇分別制成每毫升中含哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚各為0.796、0.530、0.490、1.382、1.058、1.874 mg的單成分對照品儲備溶液。再分別依次量取2.5、1.0、1.0、2.5、2.5、2.5 mL，置同一量瓶中(50 mL)，用50%甲醇稀釋制成百效丸檢測用混合對照品溶液。

2.2.2百效丸供試品溶液 取百效丸適量，剪碎，稱取4.0 g，精密稱定，將其置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定其重量，KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得百效丸供試品溶液。

2.2.3陰性樣品溶液 按百效丸的處方和工藝過程，分別制備不含玄參、巴豆霜、厚樸(姜制)的陰性樣品，再按“2.2.2” 項下的方法制成玄參陰性樣品溶液、巴豆霜陰性樣品溶液、厚樸陰性樣品溶液。

2.3專屬性試驗精密吸取“2.2.1～2.2.3”項下的混合對照品溶液、百效丸供試品溶液、玄參陰性樣品溶液、巴豆霜陰性樣品溶液和厚樸陰性樣品溶液各適量，按上述方法進行檢測。結(jié)果陰性樣品色譜圖中，在對照品混合液所顯示的哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚對應的位置無干擾，各峰之間的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均大于3 500，色譜圖詳見圖1。

注：1為哈巴苷,2為安格洛苷C,3為哈巴俄苷,4為巴豆苷,5為和厚樸酚,6為厚樸酚

2.4線性關系考察分別精密吸取“2.2.1”項下對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別用50%甲醇稀釋至20 mL，振搖均勻，制成20倍濃度差的6種不同濃度的混合對照品溶液，依法測定，以哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚及厚樸酚的質(zhì)量濃度X為橫坐標，測得的哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程，如表1所示。

表1 線性關系考察結(jié)果

2.5加樣回收率試驗分別精密稱取對照品哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚及厚樸酚各適量，用50%甲醇分別溶解并稀釋制成含哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚及厚樸酚為0.916、0.323、0.281、0.807、0.719、0.596 g·mL-1單一成分對照品溶液，備用。

取百效丸(批號162156)6份，剪碎，每份約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，依次精密加入上述備用對照品溶液1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、4.0 mL，再按“2.2.2”的方法制備加樣回收樣品溶液，依法測定，計算哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚及厚樸酚的回收率及相應的RSD，結(jié)果它們的回收率與相應的RSD見表2～4。

表2 哈巴苷加樣回收率實驗結(jié)果

表3 安格洛苷C加樣回收率實驗結(jié)果

表4 哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚加樣回收率實驗結(jié)果

2.6重復性試驗取百效丸樣品(批號162156)，按“2.2.2”項下制備方法制備百效丸供試品溶液6份，按“2.1”項下的色譜條件及檢測方法進行測定，分別計算哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量，結(jié)果所測6種組分含量的RSD依次為0.42%、1.51%、0.76%、1.13%、1.24%和0.90%。

2.7精密度試驗取“ 2.2.1”項下的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，依法測定各成分峰面積，結(jié)果哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的RSD (n=6)分別為1.16%、0.25%、1.29%、0.93%、1.10%和0.82%。

2.8供試品溶液穩(wěn)定性試驗取同一份百效丸供試品溶液，于室溫下0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h進樣測定哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚的峰面積值，結(jié)果室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定，所測6種組分峰面積的RSD分別為1.18%、0.74%、1.30%、0.96%、1.05%和0.54%。

2.9樣品測定取三批百效丸樣品，按“2.2.2”項下制備方法制備百效丸供試品溶液，依法進樣測定結(jié)果見表5。

表5 含量測定結(jié)果/mg·g-1

3 討論

3.1流動相的選擇在試驗過程中，作者首先考察了甲醇-水[12-13]、乙腈-水[4]、乙腈-甲醇(1∶4)與水[14-16]流動相體系，以色譜峰基線平穩(wěn)情況和所測各成分的峰形、分離效果為指標，優(yōu)選最佳的流動相體系。結(jié)果顯示乙腈-甲醇(1∶4)與水流動相體系優(yōu)于甲醇-水流動相體系和乙腈-水流動相體系，但個別色譜峰峰形和分離效果還欠佳。在此基礎上，作者又考察了乙腈-甲醇(1∶4)與1.0%冰醋酸溶液[5]、乙腈-甲醇(1∶4)與2.0%冰醋酸溶液[11]、乙腈-甲醇(1∶4)與0.2%磷酸溶液[17]、乙腈-甲醇(1∶4)與0.5%磷酸溶液[10]流動相體系，實驗結(jié)果顯示以乙腈-甲醇(1∶4)與0.2%磷酸溶液作為流動相按照文中的梯度洗脫比例進行洗脫時，所測各成分哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚峰形較好，各色譜峰之間以及各色譜峰與雜質(zhì)峰之間均能達到有效分離。

3.2提取方法的選擇在提取方式的選擇上，作者分別嘗試了加熱回流提取和超聲提取，結(jié)果加熱回流提取和超聲提取效果差異不大，考慮到檢驗過程操作的便捷性，優(yōu)選超聲提取作為百效丸供試品溶液的提取方式；在此基礎上，作者又以所測成分哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚提取率為指標，對比考察了超聲提取時間(15、30、45 min)和提取溶劑(水、50%甲醇、70%甲醇)。實驗結(jié)果表明，以50%甲醇為提取溶劑時，所測各成分綜合提取率最佳；超聲提取15 min時，部分所測成分含量偏低，超聲提取30 min和超聲提取45 min所測各成分含量差異無統(tǒng)計學意義。故本文采用50%甲醇超聲提取30 min作為百效丸供試品溶液的制備方法。

4 小結(jié)

本研究建立的百效丸中6種主成分含量同時測定的方法，填補了本品在液相色譜定量分析方面的空白，可進一步保證百效丸產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效，所建立的方法操作簡便，重復性好。但也存在著一定的不足之處，實驗過程中對照品使用量較大，檢驗成本偏高，采用一測多評法同時測定百效丸中多成分含量還在進一步研究中。

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