馬尾松莖葉中礦質(zhì)元素含量及相關(guān)酶活性對(duì)MeJA的響應(yīng)

姚瑞玲，李慧娟，張燁，張曉寧，王胤

(廣西林業(yè)科學(xué)研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530002)

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是我國(guó)南方主要的造林樹(shù)種，在廣西、福建、云南、貴州、四川等16個(gè)省區(qū)均有分布，其利用價(jià)值高、用途廣泛，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景[1-2]。馬尾松的蟲(chóng)害危害嚴(yán)重，發(fā)生面積最大，其在我國(guó)馬尾松分布區(qū)會(huì)周期性地暴發(fā)成災(zāi)，制約了馬尾松產(chǎn)業(yè)的高效發(fā)展[3]。眾多學(xué)者對(duì)馬尾松抗蟲(chóng)性方面開(kāi)展了大量研究[4-7]，但有關(guān)馬尾松誘導(dǎo)抗性機(jī)制方面的研究仍少見(jiàn)。

茉利酸甲酯(MeJA)屬茉莉酸類物質(zhì)，存在于植物體中的一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[8]。MeJA對(duì)植物有明顯的生理效應(yīng)，作為內(nèi)源信號(hào)分子不僅調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而且通過(guò)外源應(yīng)用能夠誘導(dǎo)植物對(duì)機(jī)械傷害、病蟲(chóng)害、干旱、鹽漬和低溫等逆境的防御反應(yīng)[9-11]。礦質(zhì)元素與植物的生長(zhǎng)和生理代謝活動(dòng)密切相關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，萜烯化合物影響著馬尾松的抗蟲(chóng)能力[4-5,7]，在MeJA處理后，其植株中萜烯類物質(zhì)含量增加，馬尾松抗蟲(chóng)性增強(qiáng)[6,13]，但MeJA對(duì)馬尾松莖葉中礦質(zhì)元素吸收和累積有何影響仍不明確。本研究以馬尾松幼苗為研究對(duì)象，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)，測(cè)定并分析了MeJA處理下誘導(dǎo)的馬尾松幼苗植株莖葉中礦質(zhì)元素含量及相關(guān)酶活性的變化，旨在明確在MeJA影響下馬尾松產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性時(shí)其礦質(zhì)元素的響應(yīng)機(jī)制，以期為今后開(kāi)展馬尾松對(duì)蟲(chóng)害誘導(dǎo)抗性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、高度為20-30cm，未受蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的盆栽健康馬尾松幼苗(種質(zhì)資源來(lái)自廣西寧明縣派陽(yáng)山林場(chǎng)桐棉松優(yōu)良林分)，噴灑茉莉酸甲酯(茉莉酸甲酯購(gòu)買于Sigma-Aldrich Chem.Co.，純度>95%)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2015年1月至12月，先后采用不同濃度MeJA噴灑馬尾松植株。馬尾松毛蟲(chóng)(DendrolimuspunctatusWalker)取食性及其相關(guān)內(nèi)源次生代謝物質(zhì)組分變化的觀測(cè)分析預(yù)備試驗(yàn)見(jiàn)圖1。

圖10.2mmol/LMeJA處理4周馬尾松幼苗針葉中萜烯類物質(zhì)的總離子流氣相色譜圖

Fig.1 Total ionic chromatogram of terpenoids inPinusmassonianaseedling needles after four weeks of 0.2mmol/L MeJA treatment

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的分析結(jié)果，本研究選擇處理后GC-MS分析萜類組分相對(duì)含量變化較大(圖1)，馬尾松毛蟲(chóng)拒食性明顯，且植株受傷害程度相對(duì)較輕的MeJA試驗(yàn)處理濃度，即以0.2mmol/L(pH7.0，含0.01%吐溫-20)MeJA為處理、以蒸餾水(pH 7.0，含0.01%吐溫-20)為對(duì)照(Control)。2016年4月至5月，將處理溶液葉面噴施馬尾松幼苗，每次噴施溶液量100mL/盆(盆的直徑×高為9cm×15cm)，每個(gè)處理重復(fù)8盆，共處理16盆。連續(xù)處理幼苗4周，每2d噴施MeJA溶液1次，共噴施14次，停止噴施MeJA溶液5d后采樣測(cè)定。采樣時(shí)，對(duì)照、MeJA處理各選取8株幼苗，每個(gè)處理每個(gè)重復(fù)選取1株，每株選擇處理進(jìn)行期間植株上健康、完全伸展的成熟針葉束。本試驗(yàn)在人工氣候箱(PQX-250)中進(jìn)行，溫度25℃/20℃(晝/夜)，光周期12h，光強(qiáng)6 000Lx，相對(duì)濕度85%。

1.3 礦質(zhì)元素含量測(cè)定

將馬尾松幼苗整株植株洗凈后，去掉根系再分成莖干及針葉兩部分于80℃烘箱中烘干至恒重，將烘干材料研磨成碎末狀，準(zhǔn)確稱取植株各部位的干粉末樣品0.5g進(jìn)行消煮，制成樣液用于礦質(zhì)元素的測(cè)定。礦質(zhì)元素含量測(cè)定參照姚瑞玲等[14]的方法。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮測(cè)定采用遲蓀琳等[15]的方法。

1.4 酶活性測(cè)定

硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)4種酶活性測(cè)定參照張智猛等[16]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及α=0.05和α=0.01水平方差分析及差異性顯著檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 礦質(zhì)元素含量變化

從表1可以看出，MeJA處理后馬尾松幼苗莖干中大量元素含量均無(wú)明顯變化，但針葉中大量元素含量發(fā)生了改變。其中，大量元素中N、P、Mg的含量在MeJA處理后顯著增加，尤其是N元素含量達(dá)到差異極顯著水平，相較對(duì)照增加了109%。相對(duì)而言，K、Ca含量無(wú)明顯變化。而經(jīng)檢測(cè)的B、Mn、Fe、Zn、Cu、Mo這6種微量元素，在MeJA處理前后其含量在馬尾松幼苗莖干中變化不大，但針葉中Mn、Fe、Cu、Mo微量元素的含量在MeJA處理后顯著增加，而B(niǎo)、Zn含量變化不明顯。

從礦質(zhì)元素在馬尾松幼苗不同組織部位的變化來(lái)看，以針葉的變化最為明顯。從馬尾松莖葉中不同礦質(zhì)元素的變化規(guī)律來(lái)看，莖干、針葉中N、P、Mg、Mn、Fe、Cu、Mo含量在MeJA處理下整體上均呈上升趨勢(shì)，尤其是N含量變化極為顯著。這說(shuō)明，進(jìn)行馬尾松活體植株MeJA處理時(shí)，針葉中的大量元素含量變化相較莖干更為靈敏，并以N素的變化最大。

表1 MeJA處理下馬尾松幼苗莖葉中營(yíng)養(yǎng)元素含量變化

注：表中小、大寫(xiě)字母分別表示各礦質(zhì)元素含量在α=0.05和0.01水平時(shí)同一植株組織中對(duì)照與處理間的差異顯著性，下同。

2.2 N素代謝及相關(guān)酶活性變化

為進(jìn)一步觀測(cè)MeJA處理下馬尾松植株莖葉中N元素含量變化情況，分別對(duì)其硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的含量進(jìn)行了分析,見(jiàn)表2。

表2 MeJA處理下馬尾松幼苗莖葉中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的變化

從表2中可知，與對(duì)照相比，供試幼苗莖干中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量無(wú)明顯變化，但銨硝比變化顯著，在MeJA處理后，該比值明顯下降。從針葉中N素代謝來(lái)看，硝態(tài)氮、銨態(tài)硝含量及銨硝比在MeJA處理下均變化顯著，其中硝態(tài)氮含量和銨硝比達(dá)差異極顯著水平。相較對(duì)照，針葉中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量增加，銨硝比降低。

整體上，MeJA處理后馬尾松幼苗莖干和針葉中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量增加，而銨硝比降低，但其變化趨勢(shì)以針葉部位較為明顯。從N素含量變化而言，MeJA處理下硝態(tài)氮增加幅度較銨態(tài)氮大。

硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶是無(wú)機(jī)態(tài)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)氮的4種關(guān)鍵酶，直接影響植株中N素的代謝情況。由圖2中MeJA處理后馬尾松幼苗莖葉中4種N元素代謝酶活性變化來(lái)看，在MeJA誘導(dǎo)下，莖葉中硝酸、亞硝酸還原酶活性顯著增加了，而谷氨酰胺、谷氨酸合成酶活性僅表現(xiàn)為在針葉中活性顯著增加，在莖桿中變化不明顯。

圖2 MeJA處理下馬尾松幼苗莖葉中N素代謝相關(guān)酶活性變化

3 結(jié)論與討論

N、P、K、Ca、Mg、B、Mn、Fe、Zn、Cu、Mo是植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，它們通過(guò)直接參與植物體內(nèi)重要有機(jī)化合物、植物激素、生物酶的合成或作為酶的活化劑，促進(jìn)植物的光合作用及呼吸作用，氮代謝、碳水化合物代謝，調(diào)節(jié)滲透壓及增加植物抗逆性等代謝活動(dòng)影響植物的生根過(guò)程[12,17]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)外源噴施MeJA 4周，馬尾松幼苗植株莖葉中N、P、Mg、Mn、Fe、Cu、Mo等元素含量均呈上升趨勢(shì)。N是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的重要元素，被稱為“生命的元素”，是構(gòu)成葉綠素、酶、ATP等化合物的元素；P是核酸的主要組成成分，是構(gòu)成ATP的元素；Mg和Fe是合成葉綠素所必需的，主要影響植株的光合作用；Mn在光合作用中具有重要作用，植物缺錳，光合作用就明顯降低；Cu是多種酶的重要組分，能通過(guò)調(diào)節(jié)多種酶的活性來(lái)影響植物生理代謝過(guò)程。Mo是固氮酶和硝酸還原酶的成分，氮代謝和豆科(Leguminosae)植物共生固氮與Mo密切相關(guān)[17-21]。從這幾種礦質(zhì)元素的生理功能來(lái)看，都與植物的光合作用生理代謝活動(dòng)有關(guān)。以往研究證明，在MeJA誘導(dǎo)下，馬尾松植株中誘導(dǎo)抗性增強(qiáng)，揮發(fā)性萜烯類物質(zhì)增加[6-7]。馬尾松產(chǎn)脂能力強(qiáng)，萜烯類化合物代謝旺盛，其中以揮發(fā)性單萜烯類物質(zhì)含量最高[22]。從萜烯類物質(zhì)的合成代謝途徑來(lái)看，單萜烯類物質(zhì)合成代謝場(chǎng)所主要為質(zhì)體(包括葉綠體、白色體、有色體)，合成前體為葡萄糖，與光合作用密切相關(guān)[23-27]。因此，在本試驗(yàn)研究中，相關(guān)礦質(zhì)元素的含量變化是否是會(huì)改變馬尾松植株的光合能力，從而改變萜烯類物質(zhì)的合成代謝，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)馬尾松誘導(dǎo)抗性能力增強(qiáng)，這需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

在養(yǎng)分代謝中，莖干主要負(fù)責(zé)植物養(yǎng)分的運(yùn)輸，而葉片則是植物合成與積累養(yǎng)分的重要部位[15]。在外源噴施MeJA處理下，本試驗(yàn)中馬尾松幼苗植株莖干和針葉中礦質(zhì)元素含量的變化以針葉較為顯著。葉片是林木光合作用的主要器官，葉中營(yíng)養(yǎng)元素含量最能反映植株新陳代謝的特點(diǎn)，最有代表性[28]。結(jié)合礦質(zhì)元素變化結(jié)果來(lái)看，這說(shuō)明今后在進(jìn)行馬尾松誘導(dǎo)抗性機(jī)制研究中，為科學(xué)、準(zhǔn)確地反映試驗(yàn)研究結(jié)果，取樣時(shí)應(yīng)以針葉作為研究對(duì)象。

在本試驗(yàn)研究中，根據(jù)不同礦質(zhì)元素含量對(duì)MeJA響應(yīng)的變化趨勢(shì)來(lái)看，以N素變化最為顯著。從N素含量變化結(jié)果來(lái)看，在MeJA處理下硝態(tài)氮與銨態(tài)氮含量都增加了，但硝態(tài)氮含量的增幅明顯比銨態(tài)氮含量的大。植株中N素代謝是從硝態(tài)氮銨態(tài)氮有機(jī)氮的過(guò)程，要實(shí)現(xiàn)無(wú)機(jī)氮到有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化，與硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的活性密不可分[29-31]。通過(guò)外源噴施0.2mmol/L的MeJA溶液4周，馬尾松幼苗植株莖葉中硝酸、亞硝酸還原酶活性明顯增強(qiáng)，這可能是MeJA誘導(dǎo)下增加的硝態(tài)氮激發(fā)了硝酸和亞硝酸還原酶活性所致；而莖干中谷氨酰胺與谷氨酸合成酶活性偏低，則可能與莖干中銨態(tài)氮含量較低有關(guān)。這就是說(shuō)，在MeJA處理下，馬尾松幼苗植株中硝酸、亞硝酸還原酶與谷氨酰胺、谷氨酸合成酶的活性分別與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量呈正相關(guān)的變化關(guān)系。在開(kāi)展馬尾松抗蟲(chóng)能力的調(diào)控中，適當(dāng)增加植株中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量，并以較低的能誘導(dǎo)N元素代謝酶活性增強(qiáng)，加快N元素轉(zhuǎn)化與利用，有效發(fā)揮N素在馬尾松誘導(dǎo)抗性中的作用。

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