外周血胎兒游離DNA檢測在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的價(jià)值

吳玥麗 張琳琳 趙 玲 朱重陽 李 琳 李 瑩

河南省婦幼保健院(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院)(鄭州，450052)

染色體非整倍體是妊娠早中期常見的染色體異常，胎兒非整倍體是新生兒出生缺陷、圍產(chǎn)期胎兒死亡的主要原因。產(chǎn)前篩查是降低染色體異常兒出生行之有效的手段。羊水染色體核型分析診斷胎兒非整倍體準(zhǔn)確率較高，達(dá)98%～99%[1]，是診斷胎兒染色體非整倍的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法屬于有創(chuàng)性操作，可增加術(shù)后流產(chǎn)、羊水滲漏、宮內(nèi)感染等風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)生率達(dá)0.3%～1.0%[2]，且不適用于有羊水穿刺禁忌孕婦。因此無創(chuàng)產(chǎn)前檢測成為胎兒染色體異常篩查的研究方向，而傳統(tǒng)無創(chuàng)性篩查的假陽性率達(dá)5%～8%[3]。孕婦外周血胎兒游離 DNA 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測是對高通量大規(guī)?；蚪M測序，大大提高了準(zhǔn)確率，其檢查敏感性、特異性可達(dá)99%，假陽性率為0.1%[4]。本研究回顧性分析了本院行外周血胎兒游離DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測及羊水穿刺胎兒染色體核型分析的孕婦資料，探討其檢測診斷胎兒非整倍體染色體的效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入對象均為產(chǎn)前診斷的適應(yīng)對象，孕婦年齡≥35歲；唐氏征篩查高風(fēng)險(xiǎn)；不良妊娠史；孕早期服用致畸藥物；孕育染色體異常胎兒病史；染色體異常家族史；羊水過多或過少；B 超提示胎兒異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：資料缺失；正常妊娠孕婦。依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)選擇2017年1月—2017年12月于本院行外周血胎兒游離DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測和羊水穿刺胎兒染色體核型分析的孕婦616例，年齡(38.0±2.1)歲(35～39歲)，孕周(20.4±5.2)周(12～24周)。

1.2 DNA檢測

采集孕婦外周血 10 ml 于EDTA 抗凝管充分混勻中，4℃條件下分離血漿提取DNA，紫外分光光度法鑒定DNA純度和完整性，運(yùn)用高通量基因檢測技術(shù)進(jìn)行DNA測序。三體高風(fēng)險(xiǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)：Z=(待測染色體的比例-總體人群的比率)/對照組待測染色體方差，Z≥3為三體高危，Z≤3為單體高危。

1.3 染色體核型分析

常規(guī)消毒，超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹壁穿刺子宮至羊膜腔抽取羊水20 ml離心取沉淀物加入羊水培養(yǎng)瓶，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱8～12d，適當(dāng)更換培養(yǎng)液;觀察羊水細(xì)胞生長良好，加入秋水仙素，經(jīng)37℃低滲、固定、制片、G顯帶、染色處理，進(jìn)行計(jì)數(shù)和染色體核型分析。采用徠卡GSL-120掃描系統(tǒng)采集分裂相,CytoVision軟件分析數(shù)據(jù),核型描述按照ISCN2016進(jìn)行描述。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

設(shè)a為真陽性數(shù)，b為假陽性數(shù)，c為假陰性數(shù)，d為真陰性數(shù)，敏感性=a/(a+c)，特異性=d/(b+d)，陽性預(yù)測值=a/(a+b)，陰性預(yù)測值=d/(c+d)。SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，ROC分析胎兒游離 DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測診斷胎兒非整倍體的效能。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測與羊水染色體核型分析

DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測共檢出胎兒染色體非整倍高風(fēng)險(xiǎn)11例，其中 21-三體高風(fēng)險(xiǎn)(47,XN,+21)5例，18-三體高風(fēng)險(xiǎn)(47,XN,+18)3例，13-三體高風(fēng)險(xiǎn)(47,XN,+13)1例；羊水染色體核型分析檢出染色體非整倍體12例，其中21-三體5例，18-三體3例，13-三體1例，符合率100%。此外，DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測性染色體非整倍體(47,XXY/47,XXX)2 例，羊水染色體核型分析結(jié)果3例，符合率66.67%；總體符合率91.67%。

2.2 DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測診斷胎兒非整倍體效能

以羊水染色體核型分析結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，游離 DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測胎兒非整倍體的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確度分別為91.7%、100.0%、100.0%、99.8%、99.8%、95.0%，ROC分析其曲線下面積為0.958(95%CI：0.867～1.000)，見圖1。

圖1 胎兒游離DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測診斷胎兒非整倍體的ROC圖

3 討論

我國每年新生兒為出生缺陷兒中10%為遺傳因素導(dǎo)致[5]，而染色體異常新生兒中95%為非整倍體異常[6]，產(chǎn)前篩查是降低染色體異常胎兒的主要措施。醫(yī)學(xué)界一直在尋找一種無創(chuàng)獲得胎兒DNA的方法。母體外周循環(huán)血中胎兒細(xì)胞數(shù)目十分微量，如何有效提取胎兒細(xì)胞成為無創(chuàng)檢測胎兒DNA的關(guān)鍵，游離胎兒 DNA 片段的發(fā)現(xiàn)[7]，促進(jìn)了無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測突飛猛進(jìn)的發(fā)展。Dan等[8]采用高通量測序技術(shù)檢測來自母體血漿中的胎兒游離DNA片段，檢測染色體異常與有創(chuàng)檢測結(jié)果符合率達(dá)100.0%。近年來，國內(nèi)也開展了大量無創(chuàng)檢測胎兒DNA的研究，均取得了較高的檢測準(zhǔn)確率[9]。

本研究采用高通量測序技術(shù)檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA片段，與羊水染色體核型分析結(jié)果比較，胎兒染色體非整倍與核型分析符合率100.0%。從診斷效能來看曲線下面積達(dá)0.883，靈敏度和特異度達(dá)88.0%、82.6%，驗(yàn)證了該技術(shù)的臨床價(jià)值。表明，孕婦外周血胎兒游離DNA檢測可有效檢測胎兒染色體非整倍體異常。DNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測性染色體非整倍體與羊水染色體核型分析符合率66.7%,總體符合率達(dá)91.7%。無創(chuàng)檢測技術(shù)對性染色體異常的檢測效能較低，可能與孕婦游離 DNA 含量有關(guān)；或與孕婦性染色體異常嵌合體或局限性胎盤嵌合體有關(guān)，因?yàn)樵袐D本人為性染色體異常嵌合體或存在局限性胎盤嵌合體會(huì)造成測試結(jié)果不準(zhǔn)確[10]。

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)也存在一定的局限性：無法完全區(qū)分母體來源DNA片段與胎兒游離DNA片段；由于檢測到的胎兒游離DNA片段來自母體胎盤滋養(yǎng)層脫落細(xì)胞，該細(xì)胞在母體外周血中含量極少，使檢測結(jié)果受取材質(zhì)量的限制較大[11]；由于胎兒游離DNA來自滋養(yǎng)層細(xì)胞，如果存在局限性胎盤嵌合，滋養(yǎng)層細(xì)胞異常，而胎兒正常，由此導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性；該方法檢測的是胎盤滋養(yǎng)層DNA，在無法有效區(qū)分胎兒DNA 和母體 DNA情況下，難以根據(jù)DNA基因測序結(jié)果推斷染色體非整倍體[12]。因此，臨床診斷非整倍體胎兒仍需要結(jié)合多項(xiàng)檢測結(jié)果做出最終判斷，不能僅依賴單一的檢測手段。

綜上，無創(chuàng)性胎兒游離DNA檢測可有效檢出胎兒染色體非整倍體，實(shí)現(xiàn)了通過分析母體血樣診斷胎兒情況的無創(chuàng)檢測，為臨床診斷提供了多種選擇的可能，是一種可靠的產(chǎn)前檢測方法，但不排除存在假陽性及假陰性的可能。