宮頸癌組織中miR-206、BAG3表達(dá)水平與臨床意義

李春茹 胡長青 戰(zhàn) 揚(yáng)

1.山東省夏津縣人民醫(yī)院(253200)；2.山東省德州市人民醫(yī)院

我國目前宮頸癌居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位[1]。微小RNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼RNA，能夠與對應(yīng)的靶基因配對達(dá)到降解信使RNA或抑制其翻譯，從而影響細(xì)胞的發(fā)育、增值、分化、凋亡等生命過程[2]。有文獻(xiàn)報道，miRNA具有原癌基因和抑癌基因的作用，對腫瘤的形成、發(fā)展等起著重要的作用[3-4]。宮頸癌患者體內(nèi)的miRNA與正常女性存在明顯差異[5]。BAG基因是近年來發(fā)現(xiàn)的對細(xì)胞凋亡起抑制作用的基因家族，家族中存在多個系列，分別命名為BAG(1-6)，該系列基因分泌多功能相結(jié)合的蛋白分子能夠參與細(xì)胞存活、凋亡、增值等過程。在BAG基因中最常見的BAG3能夠?qū)?xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，該基因在胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤組織細(xì)胞中均有表達(dá)[6]。本文通過檢測宮頸癌組織中miR206、BAG表達(dá)，分析兩種指標(biāo)對臨床病理影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2010年1月—2012年1月收治的宮頸癌患者80例臨床資料，年齡27～69歲。其中鱗癌69例，腺癌11例，均行病理檢查確診且無合并性疾病以及免疫相關(guān)性疾病。病理分級為G121例，G235例，G324例；按照現(xiàn)有國際婦產(chǎn)聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)為Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ～Ⅳ期34例。術(shù)后取組織標(biāo)本液氮置-80℃保存，記錄患者臨床、病理資料。本次參與研究患者均未接受放療和化療，且通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 定時定量PCR(RT-PCR)

1.2.1組織總RNA提取及質(zhì)量鑒定取少量冷凍宮頸癌或正常組織，超聲勻漿后加入1ml TRIzol試劑提取組織中RNA，使用DEPC溶解，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性；使用Bio-Rad檢測RNA濃度以及純度，使用分光光度計(jì)測定A260和A280并計(jì)算兩者比值(A260/A280)，1.8～2.0備用。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄500ngRNA，同時加入以下試劑：5×Buffer2ul，RT-Mix0.5ul，5×RT primer2ul，加入DEPC水至10ul。按照溫度梯度反應(yīng)37℃15min、85℃5s、0℃5min，反應(yīng)后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)體系2×PremixExTaq2ul，2×MicroRNA1ul，cDNA2ul，10×ROXⅡ2μl添加高溫高壓滅菌水至20ul。在反應(yīng)儀器中反應(yīng)30s(95℃)變性處理；再進(jìn)行PCR梯度反應(yīng)循環(huán)40次，95℃5s、60℃34s，以U6RNA為內(nèi)參，按照相關(guān)方法測定循環(huán)閾值(Ct值)，計(jì)算Δ Ct=miR206 Ct值、-U6 Ct值，以2-ΔΔCT表示miR-206表達(dá)水平[7]。

1.3 免疫組化

采用二步法免疫染色方法，石蠟包埋切片制片。使用二甲苯脫蠟30min，無水乙醇洗5min,采用高梯度酒精每個洗5min(95%、80%、70%)，最后蒸餾水及PBS緩沖液各洗5min。置于pH6.0的枸櫞酸緩沖液中，高壓煮沸1min，自然冷卻，PBS沖洗。添加一抗[(兔抗體BAG3多克隆抗體工作液(1：1000)，二抗工作液(1:100)]，4℃冷藏保存，PBS沖洗數(shù)分鐘；DAB顯色，反應(yīng)時間 30～50s，在顯微鏡下觀察控制，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽性顆粒而周圍組織無特異性顯色時停止蒸餾水沖洗，改用PBS沖洗5min×3次。蘇木素復(fù)染，返藍(lán)。按照梯度酒精脫水干燥，樹膠封片，同時以PBS溶液代替一抗作陽性對照。

1.4 隨訪調(diào)查

對80例宮頸癌患者定期隨訪60個月，了解患者腫瘤發(fā)展?fàn)顩r以及生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織miR-206表達(dá)

計(jì)算A260/A280比值符合要求，凝膠電泳檢測顯示25s、16s和5s條帶清晰，見圖1。

圖1 部分總RNA凝膠電泳

2.2 宮頸癌組織miR-206表達(dá)與病理特征關(guān)系

數(shù)據(jù)分析顯示，不同的病理分級、間質(zhì)浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中miR比較存在差異(P<0.05)；年齡、臨床分期、腫瘤大小以及絕經(jīng)情況與組織中miR-206無差異(P>0.05)。見表1。

2.3 宮頸癌組織BAG蛋白表達(dá)

80例宮頸癌組織以及癌旁組織免疫組化檢測結(jié)果顯示，有51例宮頸癌組織中BAG3蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，29例癌旁組織BAG3蛋白表達(dá)高于宮頸癌組織，見圖2。

2.4 BAG蛋白表達(dá)與臨床病理關(guān)系

數(shù)據(jù)分析顯示，BAG3的表達(dá)與年齡、腫瘤大小、分期、間質(zhì)浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、死亡等不相關(guān)(P>0.05)，與腫瘤分化、是否復(fù)發(fā)具有相關(guān)性(P<0.05)。通過Cox模型多因素分析，宮頸癌中BAG3表達(dá)是影響宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。見表2、表3。

2.5 miR-206、BAG3表達(dá)對宮頸癌患者生存影響

隨訪結(jié)果顯示，miR-206低表達(dá)患者生存時間(38.1±8.2月)低于高表達(dá)患者生存時間(55.3±5.1月)(P=0.031)。BAG3低表達(dá)患者生存時間(56.3±3.9月)高于高表達(dá)患者生存時間(35.4±7.9月)(P=0.023)。

表1 宮頸癌組織中miR-206表達(dá)與病理特征的關(guān)系

A：宮頸癌組織中陽性表達(dá) B：癌旁組織中陽性表達(dá) C：宮頸癌組織中陰性表達(dá) D：癌旁組織中陰性表達(dá)圖2宮頸癌組織及癌旁組織總BAG3的表達(dá)

表2 不同臨床病理特征宮頸癌組織BAG蛋白表達(dá)

表3 宮頸癌患者預(yù)后的Cox模型多因素分析

3 討論

近年來，對腫瘤的研究已經(jīng)從組織水平深入到基因水平，宮頸癌的發(fā)生、變化是受到多種基因影響且機(jī)制復(fù)雜的過程[8-9]。miRNA參與細(xì)胞生長過程，近年來成為醫(yī)學(xué)研究腫瘤發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)[10]。大量文獻(xiàn)報道m(xù)iRNAs在體內(nèi)的變化與腫瘤的發(fā)生、成長具有重要的聯(lián)系[11-12]。miR-206是一種腫瘤抑制miRNA，尤其在惡性腫瘤中起重要作用，文獻(xiàn)報道m(xù)iR-206能夠在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌等表達(dá)下調(diào)，可明顯抑制細(xì)胞侵襲[13-14]。本次數(shù)據(jù)看出，病理分級不同患者，體內(nèi)miR-206存在明顯不同。說明不同的分化程度能夠直接影響到體內(nèi)miRNA的含量。間質(zhì)浸潤深度也對該項(xiàng)指標(biāo)存在較大的影響，浸潤越深，miR-206含量越低，與腫瘤分化程度存在正相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，miR-206含量明顯下降，與淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者存在差異，但在臨床分期、年齡、腫瘤大小以及是否絕經(jīng)等方面未見差異，說明這些指標(biāo)不是影響宮頸癌的重要因素。以上結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[15-16]，印證了miR-206對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。

BAG3廣泛存在惡性腫瘤中，參與整個腫瘤形成發(fā)展過程[17]，但BAG3在宮頸癌中的表達(dá)相關(guān)研究文獻(xiàn)較少。本研究觀察了BAG3在宮頸癌組織、癌旁組織表達(dá)，結(jié)果存在不同，因此通過BAG3檢測可從蛋白水平來深入研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。另外，BAG3表達(dá)與不同腫瘤分化程度及復(fù)發(fā)與否均有差異，但BAG3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否不存在差異。5年的定期隨訪結(jié)果顯示miR-206低表達(dá)患者生存時間低于高表達(dá)患者，BAG3低表達(dá)患者的平均生存時間高于高表達(dá)患者，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[18]。BAG3的表達(dá)為宮頸癌的獨(dú)立因素，提示可從蛋白分子水平開展相關(guān)宮頸癌的發(fā)生機(jī)制研究。

綜上，宮頸癌組織與癌旁組織miR-206及BAG3表達(dá)均存在不同，且兩者間呈負(fù)相關(guān)。通過尋找更合適的miRNA以及蛋白表達(dá)來反映宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，可為臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。