施氮量對間作小麥蠶豆根系分泌大豆異黃酮的影響*

劉英超, 肖靖秀, 湯 利, 鄭 毅,2**

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 昆明 650201; 2. 云南省教育廳 昆明 650223)

植物根系作為植物體的吸收和代謝器官, 對于外界環(huán)境條件反應(yīng)非常敏感[1]。大量研究表明, 植物根系及其分泌物質(zhì)在植物營養(yǎng)和病害調(diào)控方面具有十分重要的作用[2-3]。因此, 根系分泌物的研究一直為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

近年來, 關(guān)于根系分泌物在輪作、間作等種植體系中的作用, 國內(nèi)外已有大量的研究和報(bào)道。而黃酮類根系分泌物質(zhì)作為被根瘤菌感知的初始信號,在豆科作物結(jié)瘤過程中起關(guān)鍵作用[4]。關(guān)于豆科植物根系分泌的黃酮類物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)主要集中在單作大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicagosativa)、豌豆(Pisum sativum)和木豆(Cajanus cajan)上, 并且在這些豆科作物根系分泌物中先后發(fā)現(xiàn)了柑桔素、圣草酚、芹菜素、毛地黃黃酮、槲皮黃酮等黃酮類物質(zhì)[5-8]。大豆異黃酮作為植物根系分泌的一種普遍的黃酮類物質(zhì), 有報(bào)道稱該物質(zhì)具有抗溶血、抗氧化、誘導(dǎo)大豆結(jié)瘤、抗病原菌生長等生理活性, 在植物體內(nèi)可作為保護(hù)性物質(zhì)保護(hù)植物正常生長, 抵制病蟲侵害[9]。另外, 有研究表明, 大豆異黃酮是大豆根瘤菌結(jié)瘤基因的誘導(dǎo)物質(zhì)[10], 并且還是大豆組織對疫霉根腐病菌侵染的反應(yīng)物質(zhì)[11]。但這些發(fā)現(xiàn)均是在單作條件下的研究結(jié)果, 間作種植尤其不同施氮水平下對黃酮類物質(zhì)分泌的影響并不清楚。

小麥(Tricum aestivum)蠶豆(Vicia faba)間作是云南乃至西南地區(qū)重要的間作種植模式, 具有顯著的增產(chǎn)[12]、控病優(yōu)勢[13], 是農(nóng)民增產(chǎn)增收的重要手段之一[14]。前人的研究已經(jīng)明確了小麥蠶豆間作系統(tǒng)中養(yǎng)分的吸收利用規(guī)律[15-16]、病害發(fā)生規(guī)律[17]、根際微生物的動態(tài)變化特征[18]、根際有機(jī)酸酚酸等的分泌特點(diǎn)[19], 表明間作對產(chǎn)量增加、病害控制和根際微生物的變化有重要影響, 對根系分泌物的變化有明顯調(diào)節(jié)作用。但是間作對這種影響作用是否受到不同施氮水平的調(diào)控并不清楚。本研究以小麥蠶豆間作為研究對象, 利用高效液相色譜(HPLC)分析技術(shù), 結(jié)合前人的小麥蠶豆根系分泌物研究結(jié)果,探討不同時期不同氮水平條件下, 間作小麥和蠶豆根系分泌大豆異黃酮的動態(tài)變化及累積特征, 為進(jìn)一步探明間作增產(chǎn)和控病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與作物品種

盆栽試驗(yàn)于2014年10月—2015年5月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)系溫室內(nèi)完成, 試驗(yàn)種植土取自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山紅壤, 基本理化性質(zhì)為: 堿解氮68 mg·kg-1, 速效磷 16 mg·kg-1, 速效鉀 137 mg·kg-1,pH 6.08, 有機(jī)質(zhì)28.07 mg·kg-1。試驗(yàn)所用盆缽大小為238 mm×320 mm, 每盆裝土10 kg。

水培試驗(yàn)培養(yǎng)液采用莫拉德配方表(mol·L-1):K2SO40.75×10-3、MgSO40.65×10-3、KCl 0.1×10-3、Ca(NO3)22.0×10-3、KH2PO40.25×10-3、H3BO31.0×10-5、MnSO41.0×10-6、CuSO41.0×10-7、ZnSO41.0×10-6、(NH4)6Mo7O245.0×10-6和 Fe-EDTA 1.0×10-4。試驗(yàn)所用容器為容積3 L的PVC桶, 桶大小為160 mm×240 mm。

供試小麥品種為‘云麥 42’, 蠶豆品種為‘玉溪大粒豆’, 種子均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院糧食作物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

小麥蠶豆間作試驗(yàn)采用盆栽和水培兩種模式完成。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為兩因素試驗(yàn)。A為種植方式, 設(shè)小麥蠶豆、小麥單作、蠶豆單作3種種植模式; B為氮肥施用水平, 設(shè)低氮、常規(guī)氮(推薦)和高氮3種氮素供應(yīng)水平。其中, 所有試驗(yàn)低氮處理均為推薦施氮量的一半, 高氮處理為推薦施氮量的1.5倍。盆栽和水培試驗(yàn)均為9個處理, 每個處理3次重復(fù), 采樣4次, 共計(jì)108桶。水培試驗(yàn)每盆移栽的幼苗為間作4株蠶豆、8株小麥, 單作8株蠶豆、16株小麥; 土培試驗(yàn)為間作6株蠶豆、12株小麥, 單作12株蠶豆、24株小麥, 均分2行種植。

所用肥料: 盆栽試驗(yàn)所用氮肥為尿素, 正常氮肥施用量為 150 mg·kg-1, 低氮用量為 75 mg·kg-1, 高氮用量為225 mg·kg-1; 磷肥品種為過磷酸鈣, 施用量為100 mg·kg-1; 鉀肥為硫酸鉀 100 mg·kg-1。磷鉀肥全部作為基肥一次性施入; 氮肥 1/2為基肥, 1/2為追肥,并于拔節(jié)期追施。氮肥追施時僅施用于間作處理的小麥一側(cè), 蠶豆均不施用追肥。水培試驗(yàn)所用氮肥為Ca(NO)3溶液, 其供應(yīng)濃度為 2.0×10-3mol·L-1。幼苗期常規(guī)氮處理添加Ca(NO)3溶液50 mL, 低氮處理添加25 mL, 高氮處理添加75 mL, 并隨生育期變化調(diào)整用量。

管理方式: 整個生長過程中, 單、間作小麥、蠶豆采用統(tǒng)一的肥水管理措施。盆栽試驗(yàn)每7 d澆水一次, 使土壤水分達(dá)到田間持水量的 70%; 水培試驗(yàn)營養(yǎng)液每3 d更換一次, 且營養(yǎng)液內(nèi)保持通氣, pH控制在6.80～6.95范圍內(nèi)。

1.3 樣品收集

分別于出苗后60 d、95 d和131 d(小麥分別處于拔節(jié)期、開花期和灌漿期, 蠶豆分別處于分枝期、開花期和結(jié)莢期)采集植株樣品, 收取根系分泌物。根系分泌物收集方法: 將盆栽和水培植株分別從培養(yǎng)容器中小心取出, 先用自來水反復(fù)沖洗植株根,后用蒸餾水沖洗3次, 沖洗后放入5%濃度百里酚溶液中浸泡 3 min, 取出后放入裝有 500 mL 0.005 mol·L-1CaCl2溶液的收集袋中, 將袋子放入原生長容器中, 每次采樣10:00開始, 通氣收集根系分泌物2 h, 收集后將植株取出, 收集液整理后存放在–20 ℃冰箱冷凍備用[19]。將成熟期植株樣品收集后烘干稱重, 測定作物產(chǎn)量。

1.4 樣品處理與測定

將收集的根系分泌物解凍后用濾紙過濾, 分別用200 mL、100 mL、50 mL乙酸乙酯萃取過濾液3次, 將 3次萃取液混勻后倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮, 濃縮液用甲醇沖洗并定容至10 mL備用。將準(zhǔn)備好的10 mL樣品過0.45 μm濾膜后放入HPLC中測定大豆異黃酮含量。

試驗(yàn)所用色譜柱為 Synergi 4u Hydro-RP 80A(250 mm×4.6 mm ID), 測定流動相A為色譜純甲醇, B為超純水, 洗脫條件為: A 30%～40%(5 min)→40%～60%(10 min)→60%～90%(25 min)→90% (29 min)→90%～30%(34 min)→30%(37 min)→ 停 止 洗 脫(37 min)。液相色譜測定條件: 波長 270 nm、柱溫30 ℃、流速0.9 mL·min-1, 在選定的色譜條件下, 得到大豆異黃酮(1 000 ng·mL-1)的混合標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的色譜圖[20]。檢測限為10 ng·mL-1, 根據(jù)保留時間來確定目標(biāo)黃酮, 通過外標(biāo)法計(jì)算出大豆異黃酮含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行處理和繪圖, 采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(Duncan 法,α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮量對間作小麥蠶豆籽粒產(chǎn)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明(表1), 隨施氮量增加, 小麥蠶豆籽粒產(chǎn)量均明顯增加。與低氮處理相比, 盆栽試驗(yàn)中, 常規(guī)氮和高氮小麥籽粒產(chǎn)量分別顯著增加29.3%和 50.4%, 蠶豆籽粒產(chǎn)量分別顯著增加 27.2%和 37.2%; 水培試驗(yàn)中, 常規(guī)氮和高氮小麥籽粒產(chǎn)量分別顯著提高17.6%和29.0%, 蠶豆籽粒產(chǎn)量分別顯著提高15.4%和21.0%。

試驗(yàn)結(jié)果還表明(表1), 相同氮水平下, 間作明顯促進(jìn)作物籽粒產(chǎn)量增加, 但增加量隨施氮量增加而減少。盆栽試驗(yàn)中, 不同氮水平下(N/2、N、3N/2),間作小麥籽粒產(chǎn)量相對于單作分別增加 20.9%～43.4%, 間作蠶豆籽粒產(chǎn)量相對于單作分別增加13.5%～32.3%。水培試驗(yàn)中, 不同氮水平下(N/2、N、3N/2), 間作小麥籽粒產(chǎn)量相對于單作分別增加14.3%～17.3%, 間作蠶豆籽粒產(chǎn)量相對于單作分別增加6.7%～13.6%。

表1 不同施氮量對小麥蠶豆間作系統(tǒng)籽粒產(chǎn)量的影響Table 1 Grain yields of wheat and faba bean intercropping system under different nitrogen application rates g·plant-1

2.2 施氮量對間作小麥根系分泌大豆異黃酮的影響

由表2可以看出, 隨著作物生育期的推移, 小麥根系分泌大豆異黃酮數(shù)量明顯減少; 盆栽試驗(yàn)中,高氮條件下, 小麥灌漿期(出苗后131 d)根系分泌物中未檢測出大豆異黃酮; 水培試驗(yàn)中, 常規(guī)氮于小麥灌漿期(出苗后131 d)、高氮于開花期(出苗后95 d)后根系分泌物中未檢測出大豆異黃酮。

由表2還可以看出, 同一生育時期, 隨施氮量增加, 小麥根系分泌大豆異黃酮數(shù)量減少。盆栽試驗(yàn)中,與常規(guī)和高氮處理相比, 小麥拔節(jié)期(出苗后60 d), 低氮條件下, 間作小麥大豆異黃酮分泌量分別增加36.6%和 104.8%, 單作小麥大豆異黃酮分泌量分別增加18.1%和49.6%; 小麥開花期(出苗后95 d), 低氮條件下, 間作小麥大豆異黃酮分泌量分別增加 43.4%和75.9%, 單作小麥大豆異黃酮分泌量分別增加13.1%和15.5%。水培試驗(yàn)中, 小麥拔節(jié)期(出苗后 60 d), 與常規(guī)和高氮處理相比, 低氮條件下, 間作小麥大豆異黃酮分泌量分別增加 1.3%和 139.4%, 單作小麥大豆異黃酮分泌量分別增加39.8%和95.7%。

由表2還可以看出, 同一生育期內(nèi), 相同氮水平條件下, 間作提高了小麥根系分泌大豆異黃酮的數(shù)量。尤其低氮和常規(guī)氮條件下, 小麥拔節(jié)期(出苗后60 d), 與單作相比, 盆栽試驗(yàn)間作小麥根系分泌大豆異黃酮的量分別增加29.6%和12.0%, 水培試驗(yàn)間作小麥根系分泌大豆異黃酮的量分別增加 15.3%和59.2%; 高氮條件下, 兩試驗(yàn)單、間作小麥根系分泌大豆異黃酮量差異性均不顯著。小麥開花期(出苗后95 d), 除盆栽試驗(yàn)中低氮條件下間作小麥根系大豆異黃酮分泌量比單作提高 71.4%外, 其他供氮水平下單、間作差異不明顯。

表2 不同施氮量對單、間作小麥不同生育期根系分泌大豆異黃酮的影響Table 2 Soy isoflavone secreted by mono- and inter-cropped wheat root under different N rates at different growth stages ng·plant-1·h-1

2.3 施氮量對間作蠶豆根系分泌大豆異黃酮的影響

PLS-EDA分析可以將抽象對象的集合分組成由性質(zhì)相同的對象組成的多個類別, 可以更直觀地顯示各研究對象之間的遠(yuǎn)近關(guān)系。盆栽試驗(yàn)中,PLS-EDA分析表明(圖1), 在PC1上, 單、間作蠶豆不同氮水平處理有很好地分離, 低氮處理單、間作蠶豆均分布在正方向上, 常規(guī)施肥和高氮處理單、間作蠶豆均分布在負(fù)方向上。在PC2上, 低氮處理單作蠶豆在負(fù)方向上, 而間作蠶豆在正方向上;常規(guī)施肥和高氮處理單、間作蠶豆差異不顯著。說明相比于常規(guī)氮和高氮處理, 低氮條件蠶豆根系分泌物大豆異黃酮類物質(zhì)更明顯, 同時說明低氮條件下單、間作蠶豆分泌大豆異黃酮物質(zhì)差異性顯著。水培試驗(yàn)中, PLS-EDA分析表明(圖1b),在 PC1上, 不同氮水平處理單、間作蠶豆也有很好分離, 低氮處理單作蠶豆在正方向上, 常規(guī)和高氮處理單作蠶豆在負(fù)方向上, 同時, 低氮和常規(guī)氮處理間作蠶豆也在正方向上, 高氮處理間作蠶豆在負(fù)方向上。說明無論是單作還是間作, 低氮處理與高氮均存在明顯差異。PC2上, 低氮間作蠶豆在正方向上, 低氮單作蠶豆在負(fù)方向上。說明在 PC2方向上, 僅低氮條件下單、間作蠶豆處理存在差異。

進(jìn)一步分析結(jié)果表明(圖2), 隨著生育期推移,蠶豆根系分泌大豆異黃酮數(shù)量先增加后減少, 蠶豆開花期(95 d)時, 兩試驗(yàn)中分泌量均達(dá)到最大值; 不同的是, 盆栽試驗(yàn)中, 蠶豆分枝期(60 d)時, 分泌量最少, 水培試驗(yàn)中, 蠶豆結(jié)莢期(131 d)時, 分泌量最少。

圖2結(jié)果還表明, 相同生育期內(nèi), 隨施氮量的增加, 蠶豆根系大豆異黃酮的分泌量減少。盆栽試驗(yàn)中, 與常規(guī)和高氮處理相比, 蠶豆分枝期(60 d),低氮條件下間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加11%和40.7%, 單作蠶豆差異不明顯; 蠶豆開花期(95 d), 低氮條件下間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加 39.5%和 154.4%, 單作蠶豆分別增加16.3%和 37.4%; 蠶豆結(jié)莢期(131 d), 常規(guī)氮量和高氮條件下間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加27.6%和 188.4%, 單作蠶豆分別增加 34.9%和56.8%。水培試驗(yàn)中, 與常規(guī)和高氮條件相比, 蠶豆分枝期(60 d), 低氮條件下間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加50.3%和66.3%, 單作蠶豆差異不明顯; 蠶豆開花期(95 d), 常規(guī)氮量和高氮條件下間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加 37.4%和94.4%, 單作蠶豆分別增加 69.7%和 97.1%; 蠶豆結(jié)莢期(131 d), 常規(guī)氮量和高氮條件下間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加52.8%和58.5%, 單作蠶豆分別增加72.7%和94.5%。

圖1 盆栽(a)和水培(b)試驗(yàn)不同氮水平下單、間作蠶豆根系分泌大豆異黃酮PLS-EDA分析Fig. 1 PLS-EDA analysis of soy isoflavone secreted by mono- and inter-cropped faba bean root under different N rates in pot experiment (a) and hydroponic experiment (b)

圖2結(jié)果還表明, 同一生育期內(nèi), 低氮和常規(guī)氮條件下, 間作蠶豆根系分泌大豆異黃酮數(shù)量明顯高于單作。盆栽試驗(yàn)中, 與單作蠶豆相比, 蠶豆分枝期(60 d), 低氮和常規(guī)氮條件下, 間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加64.6%和11.4%, 蠶豆開花期(95 d), 低氮和常規(guī)氮條件下, 間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加 29.9%和 9.9%; 蠶豆結(jié)莢期(131 d),低氮條件下, 間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量增加18%。水培試驗(yàn)中, 與單作蠶豆相比, 低氮和常規(guī)氮條件下, 蠶豆分枝期(60 d), 間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量分別增加23.8%和14.1%, 開花期(95 d)分別增加 49.6%和 82%, 結(jié)莢期(131 d)分別增加 14%和-0.3%。試驗(yàn)中, 不同生育期內(nèi), 高氮條件下, 單、間作蠶豆根系大豆異黃酮分泌量差異不顯著。

圖2 盆栽(上)和水培(下)試驗(yàn)不同氮水平下單、間作蠶豆根系分泌大豆異黃酮的差異Fig. 2 Soy isoflavone secreted by mono- and inter-cropped faba bean root under different N rates in pot experiment (upper) andhydroponic experiment at different growth stages (lower)

3 討論

已有研究表明, 不施氮肥或者氮肥施用量較低(50 kg·hm-2)時, ‘岷山紅三葉’(Trifoliumpratense)不同生育期異黃酮含量均較高; 隨著施肥量增加, 異黃酮含量降低[21-22]。本試驗(yàn)研究具有與之相類似結(jié)果。不同生育期, 隨施氮量增加, 小麥、蠶豆根系大豆異黃酮分泌量均明顯減少, 作物生長95 d和131 d時, 小麥高氮條件下未檢測出大豆異黃酮。這可能是因?yàn)榇蠖巩慄S酮作為根瘤菌結(jié)瘤基因的誘導(dǎo)物質(zhì),低氮條件下, 為滿足正常的生理和生長需要, 作物大量固定氮素, 根系大量分泌大豆異黃酮類誘導(dǎo)物質(zhì), 刺激根瘤菌結(jié)瘤固氮; 常規(guī)施肥和高氮條件下,氮素能滿足作物的生長需求, 作為調(diào)節(jié)結(jié)瘤固氮的誘導(dǎo)物質(zhì), 大豆異黃酮的分泌量也較少。

盧國理等[23]研究表明, 與單作相比, 雜交稻‘合系-41’與‘黃殼糯’間作可以顯著增加‘黃殼糯’葉片的類黃酮含量, 且增幅隨生育期延遲而提高、隨施氮量增加而降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 間作可以顯著提高作物大豆異黃酮的分泌量, 但這種間作優(yōu)勢僅在低氮和常規(guī)氮處理下明顯, 高氮處理下, 單、間作小麥和蠶豆根系分泌大豆異黃酮數(shù)量差異不顯著, 并且這種間作效應(yīng)會隨生育期的推移逐漸消失。

從本試驗(yàn)結(jié)果來看, 小麥根系分泌大豆異黃酮的最大量是拔節(jié)期(60 d), 并隨生育期的推移逐漸減少, 小麥灌漿期(131 d)分泌量最少, 且高氮條件下,小麥根系未檢測出大豆異黃酮的分泌; 與之不同的是, 隨生育期的推移, 蠶豆根系大豆異黃酮的分泌先增加后減少, 蠶豆開花期(95 d)根系大豆異黃酮的分泌達(dá)到最大量。本試驗(yàn)結(jié)果可以部分解釋間作小麥蠶豆根系大豆異黃酮分泌量的互補(bǔ)作用, 小麥分蘗至拔節(jié)期(60 d)時, 根系大量分泌大豆異黃酮等黃酮類物質(zhì), 但小麥為禾本科作物, 自身不具有結(jié)瘤固氮的功能, 與蠶豆互作后, 根系分泌物質(zhì)移動并刺激相鄰作物, 誘導(dǎo)蠶豆根系大豆異黃酮的分泌并結(jié)瘤固氮; 蠶豆開花期(95 d)時, 根系分泌的大豆異黃酮等黃酮類物質(zhì)增加, 刺激蠶豆周圍根瘤菌的活化[24], 進(jìn)而促進(jìn)蠶豆結(jié)瘤固氮, 而相鄰的小麥根系大豆異黃酮的分泌量逐漸減少; 至蠶豆生長結(jié)莢鼓粒期(131 d)時, 結(jié)瘤固氮作用已經(jīng)完成, 小麥蠶豆根系大豆異黃酮的分泌量均減少。

綜上所述, 本研究中, 從研究方法來看, 土培和水培試驗(yàn)中, 作物根系分泌物的收集均采用取出植株樣品后放入收集液中定時采集, 樣品采集過程中會存在一定人為因素的影響, 故兩個試驗(yàn)結(jié)果存在一定偏差。但目前尚無更為精準(zhǔn)的根系分泌物收集方法, 在今后的根際研究中, 應(yīng)采用更為準(zhǔn)確的根系分泌物采樣方法, 以便更好地進(jìn)行根際研究。從本研究結(jié)果來看, 間作種植方式和氮肥施用量均影響小麥和蠶豆根系大豆異黃酮的分泌, 進(jìn)而影響結(jié)瘤固氮, 最終影響產(chǎn)量的變化, 但其中相互影響機(jī)理及對蠶豆結(jié)瘤固氮的影響過程仍需進(jìn)一步研究和探討。

4 結(jié)論

小麥與蠶豆籽粒產(chǎn)量均隨施氮量增加而增加,與單作相比, 間作提高了作物籽粒產(chǎn)量。間作種植方式和氮肥施用量均影響小麥和蠶豆根系分泌大豆異黃酮的數(shù)量。隨施氮量增加, 小麥蠶豆大豆異黃酮的分泌量均減少; 試驗(yàn)中, 高氮條件下, 小麥生育后期(131 d)根系未檢測出大豆異黃酮。低氮和常規(guī)氮條件下, 小麥拔節(jié)期(出苗后 60 d)和開花期(出苗后95 d), 間作根系分泌大豆異黃酮的量分別高于單作22.5%、35.6%和28.8%、7.9%; 蠶豆分枝期(出苗后60 d)、開花期(出苗后95 d)和結(jié)莢期(出苗后131 d), 間作根系大豆異黃酮分泌量分別增加 44.2%、12.8%, 39.8%、46.0%和16.0%、27.0%; 高氮條件下單、間作差異均不顯著, 且這種間作效應(yīng)隨生育期推移逐漸不明顯。

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