銅綠假單胞菌對鎘脅迫水稻苗期生長與鎘積累的影響*

何小三, 王 微, 肖清鐵,2, 鄭新宇,2, 鄭梅琴,2, 朱靜靜, 韓永明,汪敦飛, 林瑞余,2**, 林文雄,2

(1. 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室/福建農(nóng)林大學生命科學學院 福州 350002; 2. 作物生態(tài)與分子生理學福建省高校重點實驗室/福建農(nóng)林大學生命科學學院 福州 350002)

鎘(Cd)具有生物蓄積性強、毒性持久及“致突變、致畸、致癌”作用[1]。環(huán)境中的鎘極易通過生物循環(huán)進入食物鏈, 進而危害人體健康[2]。據(jù)2014年中國環(huán)境狀況公報, 我國土壤 Cd污染面積達2×105km2, 約占耕地總面積的 1/6。我國已有 11個污水灌溉區(qū)的土壤鎘含量嚴重超標, 年產(chǎn)鎘米5×104t, 僅沈陽市張士灌區(qū)就約有2 533 hm2的農(nóng)田遭受鎘污染, 其中 13%的面積為嚴重污染, 水稻糙米的鎘濃度高達 0.4～1.0 mg?kg-1; 江西省大余縣鎘污染農(nóng)田面積達5 500 hm2, 嚴重污染的面積占12%[3]; 上海的沙川灌區(qū)、廣東的廣州、韶關(guān)地區(qū)、廣西的陽朔以及湖南的衡陽等地均可能產(chǎn)生鎘米[4]。農(nóng)田鎘污染已嚴重威脅我國的糧食安全,如何控制農(nóng)田鎘污染已成為當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的難題。植物、微生物等生物修復技術(shù)因具無二次污染、不破壞土壤環(huán)境、處理時間短、投資少、操作簡單、適應性廣、金屬選擇性高等特點倍受人們關(guān)注[5]。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種植物根際促生菌, 其根際集群能力強、世代時間短, 能分泌植物抗病及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等, 已被用作生防菌[6-7]。銅綠假單胞菌還具較強的重金屬耐性與富集能力, 可望用于重金屬污染環(huán)境的修復, 因而備受人們關(guān)注[8-12]。Sinha等[8]從污水中分離出 1株銅綠假單胞菌, 其細胞內(nèi)鎘濃度高達 8 mmol?L-1, 經(jīng) Zn2+和Cd2+誘導的菌株Co2+耐性濃度達3 mmol?L-1[9], 而菌株產(chǎn)生的表面活性劑對Cu2+和 Zn2+的去除率分別達 63.7%、15.3%[10]; 銅綠假單胞菌經(jīng)聚合物固定制備的菌劑對 Cu2+的最大吸附容量達 0.34 mmol?g-1(約 21.7 mg?g-1)[11]。可見,將具有較強重金屬耐性和富集能力的銅綠假單胞菌制成菌劑用于農(nóng)田重金屬污染修復, 可為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供技術(shù)支持[12]?，F(xiàn)有可供選擇的菌劑載體種類繁多、性能各異, 以硅藻土和活性炭等載體具良好的吸附性能最為常見。活性炭纖維對鎘離子的吸附率最高達 85%[13], 而硅藻土原土對重金屬離子 Pb(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)的去除率為 15.92%、3.92%[14], 已有用硅藻土做熒光假單胞菌P13菌劑的載體的研究報道[15]。但目前針對銅綠假單胞菌的研究仍然主要停留在研究其對重金屬的耐性與去除率上, 鮮見銅綠假單胞菌菌劑用于水稻鎘污染修復的研究報道。本課題組前期從水稻根際分離出 1株具有鎘富集作用的銅綠假單胞菌, 耐鎘濃度為 700 mg?L-1[16], 并對水稻生長具有一定的促進作用[17], 但有關(guān)該菌株及其菌劑對水稻生長及鎘積累的研究尚少見報道。為此, 本文擬通過水培試驗, 考察菌株載體、菌液及其制備的菌劑對水稻生長及鎘積累的影響, 為菌株應用于水稻鎘污染修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與試驗設計

供試水稻為抗鎘水稻品種‘PI312777’[18], 菌株為前期從水稻根際分離出的銅綠假單胞菌。菌劑載體材料硅藻土購買自上海秋草園藝設備有限公司, 硅藻土A的粒徑為1～3 mm, 硅藻土B的粒徑為 3～6 mm; 顆粒狀活性炭購買自上海展云化工有限公司, 比表面積約為1 000 m2?g-1。

試驗設置11個處理, 對比研究菌液、菌劑對水稻生長及鎘吸收的影響: 1)無鎘無菌(CK); 2)Cd;3)Cd+菌液A; 4)Cd+菌液B; 5)Cd+菌液C; 6)Cd+硅藻土A; 7)Cd+硅藻土B; 8)Cd+活性炭; 9)Cd+菌劑A;10)Cd+菌劑B; 11)Cd+菌劑C。各處理3次重復, 具體處理詳見表1。菌劑的制備方法參照文獻[12]。分別稱取等質(zhì)量的硅藻土A、硅藻土B和活性炭于燒杯中, 經(jīng) 121 ℃間歇式高壓滅菌 30 min 兩次后,65 ℃烘干后用于制備菌劑。在無菌條件下, 參照 3種載體材料的吸水率(硅藻土A、硅藻土B和活性炭依次為60.3%、43.3%和23.4%)加入銅綠假單胞菌菌液(以在37 ℃培養(yǎng)24 h的銅綠假單胞菌懸液計, 濃度為3.21×107CFU?mL-1), 混勻并保持載體濕潤、疏松、不結(jié)塊, 制成菌劑A、菌劑B和菌劑C, 用于后續(xù)試驗。不同菌液活菌數(shù)為: 菌液A, 2.90×109CFU;菌液 B, 2.08×109CFU; 菌液 C, 1.13×109CFU。不同菌劑接種后的活菌數(shù)量大小為: 菌劑 A(2.90×109CFU)＞菌劑 B(2.08×109CFU)＞菌劑 C(1.13×109CFU)。水稻盆栽試驗在玻璃溫室中進行。將3葉期的水稻“PI312777”秧苗移栽至裝有10 L營養(yǎng)液的塑料盆(50 cm×40 cm×15 cm)中, 每盆 20株, 秧苗采用泡沫板分隔、海綿固定, 營養(yǎng)液采用國際水稻研究所常規(guī)配方[19], pH 5.5左右, 每7 d更換1次營養(yǎng)液。在水稻生長至5葉期時進行處理, 水培4周后, 取樣, 測定水稻的生長狀況及各部位的鎘含量。

表1 水培試驗各處理的鎘、載體、菌液及菌劑添加量Table 1 Amounts of Cd2+, bacteria suspensions, carriers and microbial inoculum in different treatments of hydroponic experiment

1.2 水稻生長指標及鎘含量測定

水稻水培 4周后, 采樣各處理水稻植株, 植株根部經(jīng) EDTA-Na2浸泡去除表面吸附的鎘后,用去離子水淋洗 3次, 以吸水紙吸干根部, 然后用直尺分別測量水稻株高、根長; 采集的植株按根、莖鞘和葉3個組分分別取樣。根、莖鞘和葉樣品經(jīng)105 ℃殺青1 h、72 ℃烘干后稱重, 生物量以干重表示。最后, 各樣品經(jīng)粉碎、過篩后用于鎘含量測定。各處理3次重復。

鎘含量測定采用原子吸收火焰光度計法。根、莖鞘和葉樣品采用微波消解, 經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后用于測定。水稻地上部及全株的鎘含量為相應組分的加權(quán)平均值。遷移系數(shù)(transport factor,TF)=地上部鎘含量/根部鎘含量, 富集系數(shù)(biological concentration factor, BCF)=地上部鎘含量/營養(yǎng)液鎘含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計算和作圖采用Microsoft Excel 2007軟件進行, 采用 SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和Duncan多重比較,P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液、菌劑對水稻生長的影響

由圖1A可見, 鎘脅迫處理顯著抑制了水稻根長、株高的生長和干物質(zhì)積累, 菌液及菌劑處理后促進了水稻的生長。鎘處理水稻根長比對照(15.5 cm)顯著降低28.5%。除硅藻土B外, 其余各處理均對水稻的根長具有顯著的促進作用。菌劑C處理的根長比鎘處理增加了59.5%, 亦比CK高出 14.2%; 菌液 A、菌液 B、活性炭及菌劑 A處理的比鎘處理高出29.7%、50.5%、48.6%和41.4%,與 CK無顯著差異; 菌液 C、硅藻土 A、菌劑 B處理的依次比鎘處理高出23.4%、18.0%、18.0%,顯著低于CK(圖1A)。

鎘處理水稻株高(50.1 cm)比對照(80.3 cm)下降37.6%, 各處理亦顯著低于對照(圖1B)。經(jīng)菌液B、硅藻土A、硅藻土B處理后株高依次增加9.9%、11.8%、22.2%, 處理間差異不顯著; 菌液A、菌液C、活性炭及不同菌劑處理后株高增加32.7%～46.4%, 均顯著高于鎘處理(圖1B)。

鎘處理水稻單株生物量(0.52 g)比對照(0.80 g)下降35.0%(圖1C)。菌液C、硅藻土A、硅藻土B處理水稻生物量與鎘處理間無顯著差異, 其余處理的水稻生物量與對照無顯著差異, 但比鎘處理的高出 38.5%～67.3%, 以菌劑 B處理的生物量最高, 達 0.87 g(圖1C)。

圖1 不同菌液與菌劑處理對鎘脅迫下水稻的根長(A)、株高(B)和生物量(C)的影響Fig. 1 Root length (A), plant height (B) and biomass (C) of rice treated with different bacterial agents under cadmium stress condition

2.2 菌液、菌劑對水稻鎘含量及其遷移能力的影響

由圖2A可見, 鎘含量在水稻不同部位間存在顯著差異, 鎘含量平均值從高到低為: 根(633.8 mg·kg-1)＞莖鞘(128.5 mg·kg-1)＞葉(33.0 mg·kg-1),地上部平均鎘含量為 71.8 mg·kg-1, 顯著低于根系(633.8 mg·kg-1)和全株(188 mg·kg-1)。菌劑及活性炭處理顯著降低了水稻根、莖鞘、葉的鎘含量,降低幅度依次為 17.2%～41.2%、1.4%～59.9%、31.1%～62.6%; 鎘鈍化能力大小為: 菌劑 C/活性炭＞菌劑 A/B＞菌液 A/B＞硅藻土 A/B; 菌劑 C處理水稻根、莖鞘、葉的鎘濃度最低, 分別為500.0 mg·kg-1、68.0 mg·kg-1、21.3 mg·kg-1, 依次比鎘處理降低41.2%、59.9%、62.6%; 菌劑A處理降低了35.6%、41.8%、58.9%; 菌劑B處理降低了33.5%、43.2%、59.0%。經(jīng)菌劑 A、菌劑 B、菌劑 C及活性炭處理后, 水稻地上部鎘含量依次比鎘處理(101.3 mg·kg-1)下降了45.9%、47.9%、59.9%和 59.9%。經(jīng)菌劑及活性炭處理后, 水稻全株鎘含量為 136.2～220.1 mg·kg-1, 顯著降低(圖2A)。

從鎘的遷移系數(shù)(TF)看, 不同處理的鎘TF為0.08～0.13。添加空載體硅藻土A、硅藻土B及菌液處理后TF無顯著變化, 添加活性炭、菌劑A、菌劑B、菌劑C處理后顯著降低了TF, 降低幅度依次為 33.3%、16.7%、25.0%和 33.3%(圖2B)。從富集系數(shù)(BCF)看, 各不同處理均顯著抑制了水稻的鎘富集作用, 活性炭和菌劑C處理的BCF分別為17.8和18.3, 比鎘處理(45.0)降低了60.9%和58.8% , 菌劑A、菌劑B處理的BCF分別為23.6和23.3, 降低了 48.1%%和48.8%(圖2C)。

2.3 菌液、菌劑對水稻鎘積累的影響

從鎘積累總量看, 菌液 A處理顯著提高了鎘積累量, 菌液 B、菌液 C、硅藻土 A、硅藻土 B及菌劑 B處理在一定程度上提高了鎘積累量, 但與鎘處理無顯著差異(圖3)。菌液A、菌液B、菌液C、硅藻土A、菌劑B處理后鎘積累量依次增加了30.4%、14.9%、16.9%、5.5%、2.0%、15.0%(圖3)?；钚蕴俊⒕鷦?C處理降低了單株水稻的鎘積累, 降低幅度分別為18.2%和24.3%, 菌劑C處理的鎘積累量最低(96.8 μg), 是鎘處理的 75.7%(圖3)。菌劑A處理的鎘積累量降低了9.5%, 但與鎘處理間無顯著差異。

從各器官鎘積累量看, 根是水稻最主要的積累部位, 不同處理水稻的根部鎘積累量存在一定的差異, 但與鎘處理(85.0 μg)間均無顯著差異(圖3); 經(jīng)菌液 A處理的莖鞘的鎘積累量顯著高于鎘處理(28.3 μg), 而活性炭、菌劑C處理的則顯著低于鎘處理; 經(jīng)不同菌劑、不同載體、菌液 B處理的水稻葉鎘積累量均顯著低于鎘處理(14.6 μg)。

從地上部鎘積累量所占的比例看, 菌液 A、菌液B、菌液C處理依次比鎘處理(42.9%)提高了11.0%, 0.9%、5.8%; 活性炭、菌劑A、菌劑B、菌劑C處理則分別降低了18.3%、6.1%、7.6%、19.8%。

3 討論與結(jié)論

鎘位列重金屬污染物“五毒”之首, 可通過遷移、富集對植物產(chǎn)生毒害作用[1-2,20]。鎘脅迫往往導致植物根系伸長受抑、活力降低、根數(shù)減少, 影響植物的營養(yǎng)吸收與生長, 最終降低了生物量[21]。本研究表明, 鎘脅迫下水稻的株高、根長及干物質(zhì)積累均顯著下降, 這與前人的研究結(jié)論一致[18,22]。添加菌液及菌劑處理顯著促進了鎘脅迫水稻的生長和干物質(zhì)積累, 在一定程度上緩解了鎘脅迫, 這可能與銅綠假單胞菌具較強的重金屬耐性與富集能力, 可通過細胞表面吸附、絡合或胞內(nèi)外富集作用降低了鎘毒害有關(guān)[8-11,16]。此外, 銅綠假單胞菌還可通過次生代謝產(chǎn)生的等與 Cd2+形成難溶的沉淀[23], 通過分泌植物抗病與生長調(diào)節(jié)物質(zhì)促進生長, 表現(xiàn)出根際促生菌的作用[6-7]。

圖3 不同菌液與菌劑處理對鎘脅迫下水稻鎘積累量的影響Fig. 3 Cd accumulation of rice treated with different bacterial agents under cadmium stress condition

添加空載體也在一定程度上促進了水稻生長及其干物質(zhì)積累, 但不同載體間存在顯著差異。活性炭、硅藻土空載體具有疏松多孔的結(jié)構(gòu), 本身具有一定的重金屬吸附能力, 但其比表面積不同, 吸附性能也不同[13-14,24-27]。天然的硅藻土比表面積一般在 19～65 m2·g-1[24], 活性炭的比表面積可高達1 000～3 000 m2·g-1[25], 具有極強吸附能力, 在本研究中表現(xiàn)出顯著的鎘鈍化吸收效應。一些研究表明,活性炭對Pb2+的吸附率可達90%[26], 生物炭+石灰+硅藻土(BLD)配施處理后土壤有效態(tài)鎘可降低71.0%[27], 活性炭纖維對鎘離子的吸附率最高達85%[13], 而硅藻土原土對重金屬離子Pb(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)的去除率僅為 15.92%、3.92%[14], 因此活性炭比硅藻土具有更顯著的鎘鈍化效應[13-14,24-27]。但硅藻土與菌液制備成菌劑后, 其對鎘脅迫的緩解效應顯著大于硅藻土與菌液, 這種增效作用是否與硅藻土和菌株具有較好親和性, 促進了生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的分泌或降低了鎘的有效性等有關(guān), 有待進一步的研究加以證實。但活性炭與菌液制備成菌劑后并未觀察到這種增效作用。

一般地, 鎘脅迫水稻各器官的鎘含量高低為:根＞莖鞘＞稻谷＞葉片[28], 這與本研究結(jié)果: 根＞莖鞘＞葉片相吻合。菌液、菌劑和空載體處理, 促進了水稻生長, 同時顯著降低了各部位的鎘含量,一方面體現(xiàn)了生物量的稀釋效應, 另一方面可能通過影響水稻的鎘吸收與轉(zhuǎn)運, 降低鎘含量。硅藻土和菌液處理并不改變鎘在水稻體內(nèi)的遷移系數(shù), 活性炭和菌劑卻顯著降低了鎘的遷移, 這可能與活性炭對重金屬具有極強的吸附有關(guān)[13,26],也可能是銅綠假單胞菌對鎘的結(jié)合或通過影響水稻的次生代謝作用, 改變了鎘的形態(tài)和有效性,從而影響鎘的遷移[28]。硅藻土的吸附性能遠低于活性炭, 但與銅綠假單胞菌復合后, 有效地抑制了鎘從水稻根部向上的遷移, 降低水稻體內(nèi)的鎘濃度, 對鎘脅迫起到一定的緩解作用[16], 這也證明了銅綠假單胞菌具有應用于水稻鎘污染修復的潛力。

農(nóng)業(yè)環(huán)境重金屬污染的治理方法多種多樣,物理、化學及生物修復技術(shù)各具優(yōu)勢[29]。活性炭具有優(yōu)異的吸附性能, 在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛用作脫色劑、吸附劑, 也用于水處理等高附加值的工藝,效果極佳, 但成本高昂[30]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中, 應用活性炭去除環(huán)境中的重金屬, 投入產(chǎn)出比差, 推廣應用難度大[31]。硅藻土的吸附性能雖然不如活性炭, 但環(huán)境友好、價格低廉, 已被廣泛用作環(huán)境治理的材料[32], 與銅綠假單胞菌結(jié)合, 制成菌劑后, 對水稻生長既有一定的促進作用, 又可有效降低水稻體內(nèi)的鎘含量, 制備的菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有一定的應用前景[12]。

鎘脅迫下, 添加銅綠假單胞菌菌液及菌劑處理顯著促進了水稻的生長與干物質(zhì)積累, 降低了水稻各部位的鎘含量與富集量。添加菌劑處理顯著降低了鎘在水稻體內(nèi)的遷移系數(shù)。銅綠假單胞菌既是一種促生菌, 又可降低水稻對鎘的吸收，具有鎘污染環(huán)境修復的應用前景。

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