超聲提取的麥冬多糖聚集行為實驗研究

王小梅，金 文，程 磊，車岳鴻，傳楊陽，常 柯，郝大鵬

(西安航空學(xué)院 a.理學(xué)院；b.材料工程學(xué)院，西安 710077)

0 引言

麥冬，為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物，又名麥門冬、闊葉麥冬、沿階草等，其根如連珠節(jié)粒，肉質(zhì)呈紡錘狀，入藥。麥冬性微寒，味甘微苦，具有養(yǎng)陰生津、潤肺止咳、降血糖等功效[1-2]。麥冬多糖是麥冬的主要成分之一，同樣具有多種生物活性，如免疫活性、降血糖、抗心肌缺血、耐缺氧能力、抗過敏活性等[3-4]。湯軍等[5]研究表明，麥冬多糖能顯著增加小鼠的胸腺重量和脾臟重量，激活小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，并提高血清溶血素抗體水平，進而增強免疫活性。黃琦等[6]對47例2型糖尿病人在利用麥冬多糖治療前后分別檢測空腹血糖、餐前兩小時血糖、空腹血漿胰島素，結(jié)果表明，麥冬多糖具有降血糖及穩(wěn)定血糖的作用，能使周圍組織對胰島素抵抗降低。目前，對麥冬多糖的微觀形貌及分子鏈構(gòu)象研究較少，而微觀形貌和鏈構(gòu)象與多糖的生物活性關(guān)系密切，因此，對麥冬多糖微觀形貌及鏈構(gòu)象的研究意義重大。

原子力顯微鏡(AFM)為人們直接觀察生物大分子的微觀形貌提供了強有力的方法和手段。利用AFM可以在空氣中或者在溶液環(huán)境中直接對多糖分子進行觀察，制樣也比較簡單，檢測時能盡可能保持多糖分子的生理狀態(tài)和完整性[7-8]。而且，AFM測定多糖所需時間較短，可以獲得多糖樣品中大量單分子的統(tǒng)計學(xué)信息，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子的表面形貌和鏈構(gòu)象的分析和研究中[9-11]。本文主要利用AFM對超聲提取的麥冬多糖的表面形貌、鏈構(gòu)象進行觀測，獲得不同溶液環(huán)境中多糖分子鏈構(gòu)象，聚集態(tài)行為特征等信息，為進一步研究多糖構(gòu)效關(guān)系提供實驗依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

麥冬，浙江產(chǎn)，購于西安市萬壽路中藥市場，Sephadex G-150凝膠，DEAE-cellulose52纖維素，氯化鈉、氫氧化鈉等均為分析純試劑，實驗用水為雙蒸水。

1.2 主要儀器

FD-1A真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器公司)、SPM29500J3型原子力顯微鏡(日本島津公司)、系列層析柱2.5×60 cm(上海琪特分析儀器有限公司)、TU1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、TB-215D電子天平(精度：1/105 g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、磁力攪拌器、RE252AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

2 實驗內(nèi)容與方法

2.1 麥冬多糖的提取

麥冬塊根，60 ℃下烘干，粉碎。將200g干燥的麥冬粉末置于1000mL燒杯中，加入4倍體積的95%乙醇，于超聲波清洗器中超聲脫脂，同時攪拌20min，離心，收集殘渣，此脫脂過程重復(fù)三次，干燥殘渣。利用超聲波輔助提取麥冬多糖。超聲提取條件：超聲 10s，間隔15s，超聲次數(shù)90次，超聲功率為80W，按此提取過程提取兩次，將兩次的提取液合并，經(jīng)減壓濃縮，用四倍量95%乙醇純沉，離心，流水透析3天，真空冷凍干燥，得超聲提取的麥冬粗多糖，備用。

2.2 麥冬多糖的分離純化

DEAE-cellulose52色譜柱層析：纖維素陰離子交換劑DEAE-cellulose52經(jīng)0.5mol/LNaOH 浸泡1h，蒸餾水洗到中性，再用0.5mol/L HCL浸泡1h，蒸餾水洗到中性，再用0.5mol/L NaOH浸泡1h，洗到中性，抽氣泡，裝柱，用蒸餾水平衡24h。將超聲提取的麥冬粗多糖0.5g溶于10mL蒸餾水中，抽濾，濾液注入DEAE-cellulose52色譜柱中，洗脫液為蒸餾水，流速：6s/滴，20min/管，洗脫液用全自動部分收集器收集，利用苯酚-硫酸法在487 nm波長下檢測糖含量。繪制DEAE-cellulose52色譜柱洗脫曲線圖(以試管數(shù)目為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo))。合并各主峰溶液并濃縮，蒸餾水透析，冷凍干燥。

Sephadex G-150凝膠色譜柱層析：用適量蒸餾水浸泡Sephadex G-150葡聚糖凝膠，并用沸水煮2h，抽氣泡并裝柱，用蒸餾水平衡24h。將之前DEAE-cellulose52色譜柱層析收集的組分通過Sephadex G-150葡聚糖凝膠色譜柱分離。流速：4 s/滴，10 min/管。苯酚-硫酸法檢測。繪制Sephadex G-150凝膠色譜柱洗脫曲線圖(以試管數(shù)目為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo))。合并各主峰溶液并濃縮，蒸餾水透析，冷凍干燥。

2.3 麥冬多糖原子力顯微鏡(AFM)觀察

樣品的制備：將純化后的麥冬多糖用蒸餾水溶解，配制成1mg/mL的麥冬多糖溶液，在磁力攪拌器下攪拌4 h。將攪拌均勻的麥冬多糖樣品用蒸餾水稀釋到100ug/mL。再分別配制0.005mol/L的NaOH溶液及0.005mol/L的NaCL溶液，備用。吸取0.25mL 100ug/mL的麥冬多糖溶液，用蒸餾水、0.005mol/L NaOH溶液及0.005mol/L NaCl溶液分別定容到5mL的容量瓶中，得到不同溶液環(huán)境中(蒸餾水、0.005mol/L及0.005mol/L NaCl)5ug/mL的麥冬多糖溶液，搖勻，備用。分別取5uL不同溶液環(huán)境中5ug/mL麥冬多糖，滴到新剝離的云母片上，在室溫、大氣下自然風(fēng)干。

AFM觀測：將風(fēng)干的待測樣品分別置于原子力顯微鏡下測試，圖像均在Contact模式下獲得，探針為Si3N4，探針的微懸臂長為200 μm，彈性系數(shù)為0.28 N/m，利用原子力顯微鏡附帶的軟件對AFM圖像的形態(tài)學(xué)特征(如寬度、高度等)進行分析。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 紫外吸收及蛋白質(zhì)檢測

將超聲提取的麥冬多糖利用紫外可見分光光度計在190～400nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描(見圖1)，檢測到多糖在260～280nm無吸收峰，說明該多糖樣品中不含有蛋白質(zhì)及核酸。

圖1 麥冬多糖的紫外光譜掃描曲線

3.2 分離純化結(jié)果與分析

超聲提取的麥冬多糖經(jīng)DEAE Cellulose-52色譜柱層析分離，用蒸餾水洗脫只得到一個峰(見圖2)，將此峰收集，濃縮，注入Sephadex G-150凝膠色譜柱中層析分離，得到一個單一對稱峰(見圖3)，說明經(jīng)DEAE Cellulose-52色譜柱層析及Sephadex G-150凝膠色譜層析后得到的麥冬多糖純度較高。

圖2 麥冬多糖的DEAE-cellulose52層析柱色譜圖

圖3 麥冬多糖的Sephadex G-150凝膠層析柱色譜圖

3.3 原子力顯微鏡觀察結(jié)果與分析

3.3.1 麥冬多糖在水溶液中的原子力顯微鏡分析

圖4為5ug/mL麥冬多糖在水溶液中的AFM圖，從圖4中可以看出，麥冬多糖由聚合物長鏈折疊、纏繞形成，分枝較多。鏈的高度為1nm左右，鏈寬約為0.8μm左右，而多糖的分子單鏈直徑的理論值一般為0.1～1.0nm，我們得到的圖像寬度遠大于多糖單鏈分子的估計值，這一方面可能是由于針尖在掃描時與分子間相互作用致使多糖鏈產(chǎn)生增寬效應(yīng)；另一方面，糖鏈與帶負電的云母表面間范德瓦爾斯相互作用，使多糖分子鏈聚集平鋪在云母表面。糖鏈通過糖單元間不同的連接方式衍生出許多大小不同的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，尺寸在幾百納米到幾個微米不等，說明麥冬多糖具有高度分枝的化學(xué)結(jié)構(gòu)。麥冬多糖水溶液AFM圖像的結(jié)果與van der Waals 相互作用及鏈間氫鍵締合有關(guān)[12]。

圖4 5ug/mL麥冬多糖的AFM圖(溶劑：蒸餾水)

3.3.2 麥冬多糖在NaOH溶液中的原子力顯微鏡分析

圖5 5ug/mL麥冬多糖AFM圖(溶劑：0.005mol/L NaOH溶液)

圖5為麥冬多糖在0.005mol/L NaOH溶液中的AFM圖像，可以觀察到麥冬多糖在弱堿環(huán)境下形成如麥穗狀的多糖剛性鏈，其多糖分子鏈的平均高度在10nm左右，而多糖分子鏈的寬度約為120nm。與圖4麥冬多糖在水溶液中的AFM結(jié)果不同，這可能是由于弱堿環(huán)境下，麥冬多糖分子中的負離子發(fā)生了解離，與帶負電的云母片產(chǎn)生了更大的互斥效應(yīng)，使得麥冬多糖分子形成剛性的分子聚合鏈，使得弱堿環(huán)境下麥冬多糖形成剛性分子股。

3.3.3 麥冬多糖在NaCl溶液中的原子力顯微鏡分析

圖6為5ug/mL麥冬多糖在0.005mol/L NaCl溶液中的AFM圖像，可以觀察到麥冬多糖呈現(xiàn)出樹枝狀結(jié)構(gòu)及環(huán)狀結(jié)構(gòu)。麥冬多糖分子鏈的平均高度在10～30nm，鏈寬度為0.1～0.8um不等，這是由于在微量的Na+存在的情況下，水溶液中的無序柔性分子轉(zhuǎn)變成為了鹽溶液中的剛性分子。與水溶液中麥冬多糖分子鏈的高度進行比較，結(jié)果表明，鹽溶液中麥冬多糖單分子鏈的高度有所增加，其主要原因是由于有鹽微粒附著在多糖鏈上，而且由于Cl-的存在，多糖分子與云母片之間的靜電吸附作用減弱，使得更多的麥冬多糖分子鏈相互纏繞在一起形成更粗的分子股，因此產(chǎn)生了數(shù)枝狀剛性多糖分子鏈結(jié)構(gòu)。低視場下，可以更為清晰地觀察到麥冬多糖在鹽溶液中所呈的結(jié)構(gòu)，其剛性分子的構(gòu)象更加明顯。

4 結(jié)語

綜上所述，麥冬多糖分子的表面形貌及鏈構(gòu)象會因為溶劑環(huán)境的不同而變化，分析麥冬多糖在不同溶劑中的AFM圖像可知，麥冬多糖在水溶液中由于靜電效應(yīng)，多糖分子呈現(xiàn)柔性鏈分布在云母表面；在堿溶液中，麥冬多糖的AFM圖像與水溶液中不同，由于靜電排斥作用比在水溶液中強，使得多糖分子鏈不能呈現(xiàn)水溶液中的鏈環(huán)狀而是麥穗狀的剛性多糖分子。5ug/mL麥冬多糖在0.005mol/L NaCl溶液中時，由于靜電屏蔽效應(yīng)，多糖分子呈樹枝狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子鏈的高度也因鹽的附著而有所增高，且多糖分子與云母片之間的靜電吸附作用減弱，多糖分子相互纏繞高度增加。以上結(jié)果均表明，通過改變多糖的溶液環(huán)境，可以改變其溶液構(gòu)象，而多糖的溶液構(gòu)象與其生物活性關(guān)系密切，這為多糖溶液構(gòu)象及構(gòu)效關(guān)系的研究提供了科學(xué)的實驗依據(jù)和理論支持。

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