阿霉素大鼠腎病綜合征模型最佳劑量的篩選

包玉龍，楊 瑞，劉 禾，武曉琳，杜佳林，李顯華，夏素霞

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧沈陽 110034)

大鼠阿霉素腎病模型是現(xiàn)今公認的能較好模擬人類腎小球疾病的動物模型，被廣泛應(yīng)用于腎病研究領(lǐng)域中，大量的文獻報道了多種造模方法，但是都或多或少存在一些缺陷。因此，我們課題組通過采用尾靜脈一次性注射不同劑量的阿霉素，來驗證并最終確立適合本課題需要的最佳造模條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體重200 g～240 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司購進，許可證號SCXY(遼)2015-0001。

1.1.2 試驗環(huán)境 遼寧省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，環(huán)境合格證SYXK(遼)2012-0003；溫度20℃～23℃；濕度50%～60%；飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號SCXY(京)2014-0010。

1.1.3 藥物 阿霉素(ADR)注射用干粉，海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號16018711,規(guī)格10 mg/瓶；注射用水，華仁藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號Q1607026。

1.1.4 儀器 Daytona全自動生化分析儀， 英國朗道RANDOX公司生產(chǎn)；ES-J系列電子分析天平，沈陽龍騰電子稱量儀器公司生產(chǎn)。

1.2 方法

取體重200 g～240 g的雄性SD大鼠70只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后放入清潔代謝籠中，收集24 h尿液，檢測尿蛋白呈陰性，符合標準，將70只大鼠按體重隨機分為4組，A組為空白對照組，B組為阿霉素7.5 mg/kg劑量組，C組為阿霉素6.5 mg/kg劑量組，D組為阿霉素5.5 mg/kg劑量組，A組10只大鼠，B、C、D組各20只大鼠。將阿霉素用注射用水溶解，濃度為2 mg/mL,將鼠尾消毒后，B、C、D組一次性尾靜脈注射相應(yīng)劑量的阿霉素，A組給予相同體積的生理鹽水。各組均在造模后第14、28天分別用代謝籠接取24 h尿液測定尿蛋白，用Bradford比色法測定尿蛋白含量，取尿蛋白含量>100 mg/24 h為腎病模型成立[1]，定期稱量大鼠體重，采食量、飲水量、尿量；在造模后第2周、第4周經(jīng)眼靜脈叢采血測定肌酐、尿素、血漿白蛋白、血糖。使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計處理試驗數(shù)據(jù)，采用方差分析進行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠一般狀態(tài)的影響

試驗期間，空白對照組大鼠食欲旺盛，反應(yīng)靈敏，體重持續(xù)增加。造模大鼠造模前一切正常，造模第4天出現(xiàn)不同程度的腹瀉，食欲減退，精神不振，皮毛光澤變差；造模2周有腹水發(fā)生，體重明顯降低，背毛疏松，蜷縮煩躁，尾巴有壞死脫落現(xiàn)象；第3周出現(xiàn)輕度水腫，以足部、睪丸部較明顯，個別大鼠出現(xiàn)門齒松動脫落，后肢行走不便的癥狀。第4周時造模大鼠消瘦明顯、精神狀態(tài)較差，進入死亡高發(fā)期，造模后28 d時，A組沒有大鼠死亡， B組共計死亡12只，死亡率60%；C組共計死亡3只，死亡率15%；D組死亡1只，死亡率5%。可見B組死亡大鼠明顯多于C組和D組。

2.2 對各組大鼠體重及采食量的影響

與A組相比，造模前各組大鼠的采食量、體重沒有差異；造模后B組、C組、D組大鼠的采食量、體重明顯降低，而且有逐漸降低的趨勢，與A組比較差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.3 對各組大鼠飲水量、尿量及24 h尿蛋白定量的影響

與A組比較，B組、C組大鼠的飲水量明顯減少，與A組比較差異顯著，C組大鼠的飲水量與A組比較沒有明顯差異，但有減少的趨勢。與A組比較，B組、C組、D組大鼠的尿量沒有明顯差異，但有減少的趨勢。與A組比較，B組、C組、D組大鼠的24 h尿蛋白定量明顯升高，與A組比較差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。同時B組、C組大鼠的24 h尿蛋白定量值都高于100 mg/24 h，達到了腎病模型建立標準；D組大鼠的24 h尿蛋白定量雖然明顯高于A組，但其24 h尿蛋白定量值低于100 mg/24 h，未達到腎病模型建立標準(表2)。

表1 造模對各組大鼠體重及采食量的影響

注：與A組比，**P<0.01。

Note:Compared with group A,**P<0.01.

表2 造模對各組大鼠每天飲水量、尿量及尿蛋白含量的影響

注：與A組比，*P<0.05,**P<0.01。

Note:Compared with group A,*P<0.05,**P< 0.01.

2.4 對各組大鼠肌酐、白蛋白及尿素含量的影響

與A組比較，B組、C組、D組大鼠在造模后14 d的肌酐值沒有明顯差異；造模后28 d時B組、C組大鼠的肌酐值明顯升高，與A組比較差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義；D組大鼠的肌酐值雖有升高但與A組比較沒有顯著差異。與A組比較，B組、C組、D組大鼠在造模后14 d的白蛋白值沒有明顯差異；造模后28 d時B組、C組大鼠的白蛋白值明顯升高，與A組比較差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義；D組大鼠的白蛋白值雖有升高但與A組比較沒有顯著差異顯著。與A組比較，B組、C組、D組大鼠在造模后14 d、28 d的尿素值沒有明顯差異(表3)。

表3 造模對各組大鼠肌酐、白蛋白及尿素含量的影響

注：與A組比，*P<0.05。

Note:Compared with group A,*P<0.05.

3 討論

阿霉素造模原理。阿霉素(ADR)是一種含醌式結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物，ADR在體內(nèi)藥物代謝酶的作用下，形成半醌自由基，半醌自由基與氧化反應(yīng)生成超氧陰離子和羥自由基，兩者可通過膜的脂質(zhì)過氧化作用，對腎臟造成損傷[2]，從而誘發(fā)腎小球上皮細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞濾過膜結(jié)構(gòu)和功能，產(chǎn)生蛋白尿、低蛋白血癥、高膽固醇血癥，腎小管和腎小球發(fā)生病理變化。孫艷萍等[3]研究發(fā)現(xiàn)阿霉素可以損傷腎臟近曲小管，使近曲小管上皮細胞腫脹，扭曲，排列紊亂，部分脫失；粒體和溶酶體囊狀擴張，結(jié)構(gòu)模糊，細胞核有不同程度的損傷。除此之外阿霉素副作用還包括心臟、骨髓毒性及胃腸道反應(yīng)等，因此當使用劑量較大時?？蓪?dǎo)致模型動物的生存力減弱，而致病死率增加。

造模部位選擇。阿霉素屬廣譜抗腫瘤抗生素，是一種高效發(fā)泡劑，當發(fā)生血管外滲時，可導(dǎo)致局部組織出現(xiàn)化學(xué)性損傷，因鼠尾離軀干較遠，采用尾靜脈注射即便出現(xiàn)了滲漏也不會引起軀干組織的大面積損傷[4]，因此目前試驗中采用尾靜脈注射方式比較多。

造模方式選擇。周橋等[5-6]在保留雙腎的情況下采用尾靜脈低劑量多次注射給藥，這樣死亡率雖然低，但造模周期較長，反復(fù)尾靜脈注射極易造成阿霉素滲出而引起局部壞死、感染。采用單側(cè)腎切除后一次或多次給予阿霉素造模，該方法與保留雙腎的建模方法相比，阿霉素劑量小，減輕了阿霉素的毒副作用，但對試驗條件要求比較高，手術(shù)難度大，試驗大鼠感染病死率相對較高，試驗周期相對較長[7-9]。采用尾靜脈一次性注射造模，具有操作簡單，無需手術(shù)，成模較快等優(yōu)點；缺點是因考慮阿霉素組織毒性較強，一次性給藥劑量較大易引起試驗動物死亡，而劑量小時又難以成模，所以一次性造模成敗的關(guān)鍵因素是合適劑量的選擇。

綜上所述，我們認為采用尾靜脈一次性注射造模方法比較簡便高效，試驗中D組大鼠的24 h尿蛋白定量值低于100 mg/24 h，未達到腎病模型建立標準；B組、C組大鼠的24 h尿蛋白定量值都高于100 mg/24 h，達到了腎病模型建立標準；但是B組大鼠的死亡率高達60%，C組大鼠的死亡率為15%，所以從大鼠的死亡率、尿蛋白含量、精神狀態(tài)等綜合比較，C組模型實用性更強。通過試驗最終確立尾靜脈一次性注射阿霉素6.5 mg/kg劑量為最佳造模條件。

參考文獻：

[1] 楊維娜，于琳華，郭尚溫，等.改良阿霉素腎病大鼠模型的建立[J].西安交通大學(xué)學(xué)報，2009，30(4)： 446-452.

[2] 魏 偉，吳希美，李元建.藥理實驗方法學(xué)[M].4版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

[3] 孫艷萍,陳金和,陳賢鈞.丹參對大鼠腎臟近曲小管超微結(jié)構(gòu)保護機制的研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2003,4(3):145-147.

[4] 杜 宇，魏 紅，李海濤.阿霉素大鼠腎病模型的概述[J].中國醫(yī)藥指南，2013，11(9)：78-79.

[5] 周 橋,盧 穎,仲 芳,等.蛋白酶體抑制劑硼替佐米對阿霉素腎病大鼠腎臟的保護作用[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011,31(2):158-164.

[6] Lebrecht D，Setzer B，Rohrbaeh R，et al．Mitockmdrial DNA and its respiratory chain products are defective in doxorubicin nephrosis[J]．Nephrol Dial Transplant，2004，19(2)：329-336．

[7] Ji Z Q,Huang C W,Liang C J,et al.Protective effects of blocking reninangiotensin s stem on the progression of renal injur in glomerulosclerosis[J].Cell Mol Immunol,2005,2(2):150-154.

[8] 張麗芬,黃文政,朱小棣,等.阿霉素腎病腎小球硬化動物模型的研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2005,6(4):195-199.

[9] 趙宗江,劉 昆 ,楊美娟,等.三七總皂甙對阿霉素腎病大鼠腎組織ET1蛋白及m R NA 表達的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,30(4):226-22.